“En una aldea de Gabón con un brote de ébola el 50% de los perros de esa aldea tenían ébola y no mostraban síntomas”

National Center for Biotechnology Information

US National Library of Medicine  National Institutes of Health

Virus Ébola causa fiebre hemorrágica fulminante en los seres humanos y los primates no humanos ( 1 , 2 ).Las especies de virus Ebola Zaire (Ebola virus-Z), 1 de las 4 especies conocidas de virus Ebola, se produce en el centro de África y mata a 80% de las personas infectadas en pocos días ( 3 , 4 ). La fiebre hemorrágica del Ébola se produce en epidemias raras, en la que el paciente índice es a menudo infectadas por una fuente animal, lo que indica que la fiebre hemorrágica del Ébola es una enfermedad zoonótica ( 5 ).Durante los últimos 3 años, 5 brotes de Ebola debido al virus Ebola-Z han golpeado a la región de África central, incluyendo Gabón y la República del Congo, y causó 334 muertes entre los 428 casos reportados en humanos ( 5 ). En estudios previos, se demostró que cada brote extendido podría subdividirse en varios grupos epidémicos independientes o cadenas de transmisión, lo que dio gracias al contacto directo con una canal infectada por virus Ebola-Z. Observaciones epidemiológicas y los análisis genéticos identificados gorila, chimpancé, y los cadáveres duiker como las principales fuentes de casos humanos ( 5 ). Una vez que la barrera de las especies se ha cruzado entre los animales y los seres humanos, la enfermedad se transmite entre humanos por el contacto físico directo.

Algunos casos humanos en el reciente brote en la región de Gabón / República del Congo no tienen una fuente documentada de exposición a la fiebre hemorrágica del Ébola. Del mismo modo, 14 (4,9%) de los 284 casos en el Sudán brote 1976 ( 6 ) y 55 (17,4%) de los 316 casos durante el brote de 1995 en Kikwit (7 ), República Democrática del Congo (RDC, ex Zaire), tenido contacto físico directo con una persona infectada o conocido canal infectada. Estas observaciones apuntan a otras vías de transmisión (por ejemplo, infección del tracto respiratorio humano-humano a través de gotas y aerosoles) o pueden sugerir que otras fuentes, animales no identificados pueden estar involucrados en la transmisión del virus Ebola en seres humanos.

Los brotes de fiebre hemorrágica del Ébola se produjeron en los pueblos donde las personas se mantengan los animales domésticos, incluyendo perros. Los perros no están alimentados y tienen que hurgar por su comida. Se alimentan de pequeños animales muertos que se encuentran cerca de los pueblos y también los órganos internos de los animales salvajes cazados y sacrificados por los aldeanos. Algunos perros también se utilizan para la caza en la densa zona boscosa. Aunque la infección canina por virus Ebola nunca se ha documentado, el comportamiento y la dieta de los perros domésticos “los colocan en situación de riesgo.

Examinamos si los perros podrían haber sido infectadas por el virus del Ébola y su papel potencial como fuentes primarias o secundarias de la infección humana. Se realizó una encuesta serológica a gran escala para determinar la prevalencia de la infección por el virus Ébola en perros en un área virus Ebola-epidemia de Gabón.

Métodos

Las poblaciones de estudio

Se muestrearon 439 perros divididos en 4 grupos ( Tabla 1 ). El primero estaba formado por 102 perros que viven en Francia (controles negativos). El segundo grupo estaba compuesto por 258 perros muestreados en la zona de Gabón afectados por el brote de Ébola 2001-2002. Este grupo se subdivide en 2 grupos, 1 de 159 perros de aldeas situadas entre Mekambo y Ekata y entre Mekambo y Mazingo ( Figura 1 , Tabla 1 ) y otro de 99 perros de la ciudad Mekambo, donde también se reportaron casos humanos. El tercer grupo estaba compuesto por 50 perros de Libreville, la capital de Gabón, y 29 perros de Port Gentil, la segunda ciudad de Gabón, que se encuentra en la Costa Atlántica ( Figura 1 , Tabla 1 ). Aunque estos 2 pueblos de Gabón son ambos ubicados> a 600 km de la zona del virus Ebola-epidemia, varios casos humanos de infección por Ébola, importados desde el área de enfermedad epidémica, se observaron en Libreville durante el brote de 1996-1997.

Tabla 1

Los resultados de las pruebas de los perros mascotas para inmunoglobulina G anticuerpos Ebola-específicas por ubicación
Figura 1

Localización de las principales ciudades de Gabón (Libreville y Port Gentil) y los pueblos de la zona virus Ebola-epidemia durante el 2001-2002 brote en Gabón. Los pueblos donde se observaron casos humanos de infección por Ébola se indican mediante 

Muestreo

El muestreo se llevó a cabo de 2 maneras. 1) Los perros en Libreville y Port Gentil se muestrearon en una clínica veterinaria. La sangre se recogió en 5 mL Vacutainers secos (VWR International, Fontenay-sous-Bois, Francia), y el suero fue preparado por centrifugación. Las muestras de suero fueron almacenadas a -20 ° C hasta que fueron enviados al Centro Internacional de Investigaciones Médicas de Franceville (Gabón), donde fueron almacenadas a -80 ° C hasta el ensayo. 2) Los perros de la zona endémica de virus Ebola se tomaron muestras en los pueblos. Un equipo de veterinarios con experiencia se encuentra en Mekambo, donde las instalaciones de laboratorio de campo se establecieron; muestras de sangre se recogieron en una base diaria en las proximidades de la localidad mediante el uso de 5-ml Vacutainers secos y anestesia medetomidina. A continuación, los tubos se transportan a Mekambo cada noche, y el suero se decantó a partir de sangre entera. Las muestras de suero se mantuvieron en nitrógeno líquido en 1 ml alícuotas a Mekambo hasta que fueron transportados a CIRMF. Las muestras de suero se almacenaron a -80 ° C hasta el ensayo serológico, la detección de antígeno, y el ARN de amplificación se llevaron a cabo.

Los dueños de perros fueron entrevistados sobre las actividades de sus mascotas (por ejemplo, la participación en la caza) y la salud de la historia. El objetivo de las entrevistas era en eventos virus Ebola-potenciales de exposición, incluyendo los casos humanos que se produjeron en el pueblo y entre los dueños de perros.

Investigaciones de laboratorio

Inmunoglobulina específica del virus del Ébola (Ig) G se detectó mediante el uso de un método estándar ligado a enzimas (ELISA) como se describe previamente ( 8 ). Brevemente, las placas Maxisorp (VWR International) fueron recubiertas con antígenos del virus Ebola-Z diluido 1: 1000 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), durante la noche a 4 ° C. Las placas de control no infectadas se recubrieron con antígenos de cultivo de células Vero en las mismas condiciones. Suero diluido 1: 400 en 5% de leche sin grasa en PBS-Tween 20 (0,1%) se añadieron a los pocillos y se incubó durante la noche a 4 ° C. La unión de IgG fue visualizado utilizando un anti-perro marcada con peroxidasa IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.) y el sistema detector de TMB (Dynex Technologies, Issy-les-Moulineaux, Francia). La densidad óptica (OD) se midió a 450 nm con un lector de placas ELISA. Para cada muestra se calculó el OD corregido como el OD del antígeno recubierto bien menos la DO del control correspondiente así. El valor de corte (CO) se calculó como sigue: CO = M + 3σ, donde M es la media de la DO corregida de los 102 controles negativos de Francia, y σ es la desviación estándar. Las muestras se consideraron positivas cuando la DO corregido estaba por encima de la línea de corte.

Las muestras positivas en estos ensayos serológicos fueron utilizados para la detección de antígeno ( 9 ) y para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación viral ( 10 ). Tres positivo y 3 muestras de suero negativos también fueron utilizados para el aislamiento del virus ( 9 ). Brevemente, placas Maxisorp se revistieron con un cóctel de 7 anticuerpos monoclonales contra antígenos del virus de Ébola-Z; placas de control se recubrieron con fluido ascítico de ratón normal, producido a partir de la línea celular de mieloma parental. A continuación, se añadió suero a los pocillos, seguido de conejo hiperinmune Ébola antisuero polivalente y anticuerpos de cabra conjugada con peroxidasa de entonces contra IgG de conejo.El sistema de sustrato de peroxidasa TMB de micropocillos se utilizó para medir OD. Para la detección de ARNm viral, el ARN total fue aislado a partir de suero con el kit de ARN viral de QIAmp (Qiagen, Courtaboeuf, Francia), y se sintetizó ADNc a partir de ARNm como se describió anteriormente. Dos pares de cebadores degenerados correspondientes a la L-gen del virus de Ébola se utilizaron para 2 rondas de amplificación, que produjo un fragmento de 298 pb.

Métodos Estadísticos

Los intervalos de confianza para las proporciones se calcularon utilizando el método Clopper y Pearson (11 ). Las comparaciones estadísticas entre las tasas de seroprevalencia de acuerdo con el área de muestreo se realizaron utilizando la prueba exacta de Fisher. La prueba de Cochran-Armitage fue utilizado como una prueba de tendencia para proporciones, después de comprobar la bondad del ajuste de un modelo lineal subyacente ( 12 ). Todas las pruebas se utilizó un nivel de significación de 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R (R Development Core Team, 13 ).

Resultados

Un total de 439 muestras de sangre de los perros fueron seleccionados para IgG específica para el virus del Ébola. Dos (2%) de las 102 muestras de sangre de los perros que viven en Francia tenían detectable Ebola virus reactiva IgG ( Tabla 2 ). Siete de los 79 perros muestreados en Libreville y Port Gentil (8,9% tasa de prevalencia), 15 de los 99 perros muestreados en Mekambo (15,2% tasa de prevalencia), y 40 de los 159 perros muestreados en aldeas situadas dentro de la zona de virus Ebola-epidemia (25,2% de tasa de prevalencia) tenían IgG detectable a antígenos del virus de Ébola ( Tabla 2 ).

Tabla 2

Las tasas de prevalencia de anticuerpos de inmunoglobulina G Ebola-específica en perros de compañía procedentes de diferentes zonas y pueblos

Durante el 2001-2002 Ebola brote en Gabón, los casos humanos de infección por el virus del Ébola apareció sólo en ciertas aldeas dentro de la zona de virus Ebola-epidemia ( Figura 1 ). La prevalencia del virus Ebola-reactivo IgG entre los perros de las aldeas donde se produjeron los seres humanos los casos fue del 27,2%, frente al 22,4% entre los perros de las aldeas donde no se observaron casos humanos ( Tabla 2). En algunos casos, los cazadores habían traído de vuelta a la aldea una canal infectada con virus Ébola que se encuentra en el bosque. Este canal fue la fuente de infección humana en el pueblo, y la enfermedad se transmite de humano a humano, tanto dentro de la aldea y de otras aldeas de los movimientos de población ( Figura 1 ). De este modo, se observaron casos humanos sólo secundarias en algunos pueblos, sin ninguna fuente animal identificado. La tasa de prevalencia entre los perros de las aldeas con los casos tanto de una fuente animal y humana era tan alto como 31,8%, frente al 15,4% entre los perros de las aldeas con casos humanos, pero no hay ninguna fuente animal identificados ( Tabla 2 ).

La tasa de seroprevalencia fue significativamente menor en Francia (2,0%) que en Gabón ( Tabla 2 ). En particular, fue menor que en las ciudades importantes 2 (p = 0,043), en Mekambo (p = 0,001), y en la zona de virus epidemia de Ébola (p <0,001). La tasa de seroprevalencia en las principales ciudades (8,9%) fue significativamente menor que en la zona de virus epidemia de Ébola (p = 0,003). Valiéndose de los resultados de 1 a 4 para las tasas de prevalencia canina en Francia, principales ciudades, Mekambo y Ebola áreas virus epidémicos, se observó una tendencia positiva significativa de incremento lineal (prueba de Cochran-Armitage: p <0,0001) ( Figura 2A ).

Figura 2

La seroprevalencia del virus Ébola en los perros muestreados en diferentes áreas: A) Francia, las principales ciudades de Gabón, Mekambo (un pueblo cerca de la zona de enfermedad epidémica) y los pueblos de la zona epidémica; B) Francia, las principales ciudades de Gabón, Mekambo, pueblos sin humanos 

Las tasas de seroprevalencia en perros aumentaron linealmente a medida que el área de muestreo se acercó a los sitios de los casos humanos, según lo confirmado por la prueba muy significativa Cochran-Armitage para las tendencias en proporciones (p <0,0001), que utiliza una puntuación de 1 para Francia, 2 para los principales ciudades, 3 para Mekambo, 4 para las aldeas de la zona de la enfermedad epidémica sin casos humanos, y 5 para las aldeas de la zona de virus Ebola-epidemia con casos humanos ( Figura 2B ). El resultado se confirmó cuando restringido a las 3 últimas áreas (p = 0,04).

En paralelo, las tasas de seroprevalencia en perros aumentaron linealmente como el área de muestreo se acercó fuentes animales, como lo confirma una significativa prueba de Cochran-Armitage (p <0,0001), con una puntuación de 1 para Francia, 2 de las principales ciudades, 3 para Mekambo, 4 para los pueblos donde no se observó fuente animal (con o sin casos humanos), y 5 para las aldeas donde se observó una fuente animal (con casos humanos) ( Figura 2C ). Una vez más, el resultado se confirmó cuando restringido a las 3 últimas áreas (p = 0,01).

Tampoco se detectaron antígenos del virus de Ébola ni secuencias de nucleótidos en cualquiera de las muestras de sangre de perro positivos o negativos. Tampoco se pudieron aislar las células del virus de 3 positivos y 3 negativos en muestras de Vero-E6.

Discusión

Se investigó la posible participación de los perros domésticos en la aparición o difusión de la fiebre hemorrágica del virus del Ébola en los seres humanos. Sobre la base de una gran encuesta serológica de perros en el área del brote de Ébola en Gabón 2001-2002, encontramos evidencia de que los perros pueden ser infectados por el virus de Ebola, un hallazgo que plantea importantes problemas de salud humana. El método ELISA se basa en el uso de antígenos del virus de Ébola-Z. Aunque las reacciones cruzadas pueden ocurrir con anticuerpos frente a otros subtipos, la presencia de estos subtipos en nuestras muestras es poco probable ya que sólo el subtipo Zaire circula en el área de estudio: todos los pacientes y primates no humanos ensayados en esta parte de África central se infectaron por el Zaire subtipo solo. Los 2 perros positivos en Francia, una parte al parecer el virus Ebola-exentos del mundo, podrían atribuirse a reacciones falsos positivos debido al cálculo de la positividad de corte y la 1: paso de dilución de suero 400 utilizado en las pruebas.

Se encontró que 40 de 159 perros que viven en la zona virus epidémico 2001-2002 Ebola tenían detectable IgG específica para el virus Ébola, que indica ya sea verdadera infección o estimulación antigénica simple.Todas las pruebas se ajustará a 1: 400 dilución de suero, y la mayoría de las muestras de suero tenían valores de DO altos incluso en diluciones más altas, lo que confirma la especificidad de las reacciones.Estos datos son consistentes con las observaciones que hicimos durante los diferentes brotes de Ebola que se produjeron en Gabón y la República del Congo en los últimos años. Hemos observado que algunos perros se comieron los restos frescos de animales muertos infectados por el virus de Ebola trajo de vuelta a los pueblos, y que otros lamimos vómito de pacientes infectados por el virus de Ébola. En conjunto, estos hallazgos sugieren que los perros pueden ser infectados por el virus de Ebola, y que algunos perros que viven en las aldeas afectadas fueron infectados durante el brote del virus Ebola humano 2001-2002. No se detectaron antígenos circulantes Ébola o secuencias de ADN virales (ensayadas por PCR) en muestras de suero o bien positivos o negativos, y los intentos de aislar el virus a partir de estas muestras fallaron. Estos hallazgos indican ya sea vieja infección transitoria Ébola de los perros tratados, o la estimulación antigénica.

Los síntomas no se desarrollaron en cualquiera de estos animales altamente expuestos durante el brote, un hallazgo que tiende a apoyar la estimulación antigénica, asintomática, o infección muy leve del virus Ebola. Los animales salvajes, especialmente los gorilas y los chimpancés, también pueden ser infectados por el virus de Ebola, pero la infección es altamente letal y causa enormes brotes y descensos masivos de población ( 5 , 14 ). Otros animales como cuyes ( 15 ), caprino ( 16 ), y los caballos ( 17 ) permanecen asintomáticos o presentan síntomas leves después de la infección experimental, pero la infección del virus del Ébola nunca se ha observado en estas especies en la naturaleza. Por lo tanto, los perros parecen ser las primeras especies animales muestran que de forma natural y con infección asintomática por el virus del Ébola. La infección asintomática Ebola en seres humanos también se ha observado durante los brotes ( 18), pero es muy raro. Aunque los perros pueden ser infectados de forma asintomática, pueden excretar partículas virales infecciosas en la orina, las heces y la saliva durante un breve período antes del despacho de virus, como se ha observado experimentalmente en otros animales. Dada la frecuencia de contacto entre los humanos y los perros domésticos, canino infección del Ébola debe ser considerada como un factor de riesgo potencial de infección humana y la propagación del virus. La infección humana podría ocurrir a través de lamer, morder, o aseo. Asintomática perros infectados podrían ser una fuente potencial de brotes de Ebola humanos y del virus se propagó durante los brotes humanos, lo que podría explicar algunos casos humanos no relacionados epidemiológicamente. Los perros también pueden ser una fuente de brotes de Ebola humanos, como los 1.976 brotes Yambuku en República Democrática del Congo ( 19 ), el brote Kikwit 1995, algunos brotes que se produjeron en 1996 y 2004 en Gabón y la República del Congo ( 5 ), y el 1976 ( 6 ), 1979 ( 20 ), y 2004 ( 21 ) brotes en Sudán, las fuentes de la que aún no se conocen. En conjunto, estos hallazgos sugieren que los perros deben ser tomadas en consideración durante la gestión de brotes de Ebola humanos. Para confirmar el potencial riesgo humano de perros infectados por el virus de Ebola, los mecanismos de excreción viral (es decir, los fluidos corporales y la cinética de excreción de virus) deben ser investigados durante la infección canina experimental. Esta investigación también podría ofrecer información sobre la resistencia natural de los perros.

Las tasas de seroprevalencia caninos en Libreville y Port Gentil, las 2 ciudades principales de Gabón, fue significativamente mayor que la observada en Francia, lo que sugiere la estimulación antigénica en estos pueblos donde se han observado ningún caso de infección del Ébola. Las investigaciones epidemiológicas mostró que la mayoría de los perros seropositivos en Libreville y Port Gentil probablemente nunca habían tenido contacto con una fuente infectada (animal muerto o caso-paciente humano), y que nunca habían visitado la zona virus Ebola-epidemia, en teoría descartar infección real . Por lo tanto, pueden haber estado en contacto con antígenos virales libres, transmitida por aerosol o, en menor medida, la exposición conjuntival con experiencia para las gotitas cargadas de virus de la orina, las heces o sangre del huésped natural desconocido. Virus del Ébola se ha demostrado experimentalmente que ser transmisible a los monos rhesus por inhalación ( 22 ) y la exposición conjuntival ( 23 ). Además, se observó la transmisión accidental del virus de Ébola de 2 monos rhesus que no tenían contacto directo con monos infectados experimentalmente en un laboratorio bioconfinamiento, que también sugiere aerosol, conjuntival, o la transmisión oral ( 24 ).

Las especies reservorio del virus Ébola parece extenderse por todo el centro de África, tanto en las zonas rurales y urbanas y por lo tanto podría ser un pequeño mamífero terrestre o un pájaro. No hay buenos candidatos especies aún no se ha identificado, a pesar de extensos estudios ( 25 , 26 ). Observaciones epidemiológicas durante los 1.976 brotes en República Democrática del Congo y Sudán identifican murciélagos como reservorio potencial ( 6 , 20 ), y se detectaron secuencias de nucleótidos del virus Ébola y cápsides de virus similares al virus Ébola en los roedores en la República Centroafricana ( 27 ). El descubrimiento de perros positivos al virus de Ebola en las zonas afectadas no declaradas sugiere que estos animales viven en estrecho contacto con el reservorio del virus Ébola, y este hallazgo debería ayudar a reducir la búsqueda.

Un resultado llamativo de este estudio es el gradiente significativo el aumento de la seroprevalencia canina de Francia a la zona virus Ebola-epidemia, incluso de pueblos con y sin casos humanos en la zona. La prueba de Cochran-Armitage para las tendencias en proporciones mostró que la seroprevalencia aumentó linealmente de Francia (2%), a las ciudades principales (8,9%), a continuación, a Mekambo (15,2%) y, a continuación, a las aldeas de la zona virus Ebola-epidemia (25,2 %). Esta tendencia se ve apoyada por el aumento de la seroprevalencia en el área de muestreo se acercó a los casos humanos y de fuentes animales (prueba de Cochran-Armitage, p <0,0001). Estos hallazgos sugieren que la seroprevalencia canino podría reflejar contacto con el virus y, por lo tanto, la actividad del virus en una zona determinada y también el riesgo de infección humana.

El virus parece saltar de su huésped natural para los seres humanos sólo en condiciones específicas, pero desconocidos,. Las tasas de seroprevalencia en perros podría sirve como indicador del virus Ébola en regiones en las que no se han observado muertes de animales o los casos humanos.

En conclusión, este estudio ofrece la primera evidencia de que los perros pueden ser asintomáticos infectados por el virus de Ébola en la naturaleza. Este hallazgo tiene implicaciones potenciales para la prevención y el control de los brotes humanos. El gradiente de seroprevalencia canino pasando de bajo riesgo a las áreas de virus endémico de Ébola en riesgo indica que este seroprevalencia podría ser utilizado como un indicador epidemiológico de la circulación del virus en las regiones donde no se dispone de otros medios de detección de virus.

Agradecimientos

Agradecemos TG Ksiazek y PE Rollin, Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, Georgia, EE.UU., por su ayuda con los análisis de IgG y para proporcionar reactivos Ebola-específicas.También agradecemos a todos los que participan en la recogida de muestras y el caso de presentación de informes: los veterinarios Philippe Sarrazin, Loïc DELESTRE, Brigitte Siliart, y Marie-Pierre Vandenbroucke.

CIRMF es apoyado por el Gobierno de Gabón, Total-Fina-Elf Gabón, y el Ministère de la Coopération Française. Este trabajo también fue apoyado por una beca de Fondo de Solidaridad Prioritario del Ministère des Affaires Etrangères de la France (FSP no. 2002005700).

Biografía

Loïs Alella es inspector veterinario con el Ministerio de Medio Ambiente de Gabón. Su investigación actual se centra en la infección por el virus Ébola en los perros.

Notas al pie

Citas sugeridas para este artículo : Alella L, Bourry O, Pouillot R, Délicat A, Yaba P, Kumulungui B, et al. Virus Ébola en perros y riesgo humano. Emerg Infect Dis [serie en internet]. 2005 Mar [ fecha citada ].http://dx.doi.org/10.3201/eid1103.040981

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Ebola Virus Antibody prevalencia en perros y Riesgo Humano.

Ebola virus causes fulminant hemorrhagic fever in both humans and nonhuman primates (1,2). The Zaire Ebola virus species (Ebola virus-Z), 1 of the 4 known species of Ebola virus, occurs in central Africa and kills 80% of infected persons within a few days (3,4). Ebola hemorrhagic fever occurs in rare epidemics, in which the index patient is often infected by an animal source, which indicates that Ebola hemorrhagic fever is a zoonotic disease (5). During the past 3 years, 5 Ebola outbreaks due to Ebola virus-Z have struck the region of central Africa, including Gabon and Republic of Congo, and caused 334 deaths among the 428 reported human cases (5). In previous studies, we showed that each extended outbreak could be subdivided into several independent epidemic clusters or chains of transmission, which resulted from close contact with an Ebola virus-Z–infected animal carcass. Epidemiologic observations and genetic analyses identified gorilla, chimpanzee, and duiker carcasses as the main sources of human cases (5). Once the species barrier has been crossed between animals and humans, the disease spreads among humans by direct physical contact.

Some human cases in the recent outbreak in the Gabon/Republic of Congo region did not have a documented source of exposure to Ebola hemorrhagic fever. Similarly, 14 (4.9%) of the 284 cases in the 1976 Sudan outbreak (6) and 55 (17.4%) of the 316 cases during the 1995 outbreak in Kikwit (7), Democratic Republic of Congo (DRC, former Zaire), had no direct physical contact with an infected person or known infected carcass. These observations point to other routes of transmission (e.g., human-human respiratory tract infection through droplets and aerosols) or may suggest that other, unidentified animal sources may be involved in Ebola virus transmission to humans.

Ebola hemorrhagic fever outbreaks occurred in villages where people keep domestic animals, including dogs. The dogs are not fed and have to scavenge for their food. They eat small dead animals found near the villages and also internal organs of wild animals hunted and slaughtered by villagers. Some dogs are also used for hunting in the dense forested area. Although canine infection by Ebola virus has never been documented, domestic dogs’ behavior and diet place them at risk.

We examined whether pet dogs could have been infected by Ebola virus and their potential role as primary or secondary sources of human infection. We conducted a large-scale serologic survey to determine the prevalence of Ebola virus infection in pet dogs in an Ebola virus–epidemic area of Gabon.

Methods

Study Populations

We sampled 439 dogs divided into 4 groups (Table 1). The first group comprised 102 dogs living in France (negative controls). The second group comprised 258 dogs sampled in the area of Gabon hit by the 2001–2002 Ebola outbreak. This group was subdivided into 2 clusters, 1 of 159 dogs from villages located between Mekambo and Ekata and between Mekambo and Mazingo (Figure 1Table 1) and another of 99 dogs from Mekambo city, where human cases were also reported. The third group comprised 50 dogs from Libreville, the capital of Gabon, and 29 dogs from Port Gentil, Gabon’s second largest town, located on the Atlantic Coast (Figure 1Table 1). Although these 2 Gabonese towns are both located >600 km from the Ebola virus–epidemic area, several human cases of Ebola infection, imported from the disease-epidemic area, were observed in Libreville during the 1996–1997 outbreak.

Table 1

Results of testing pet dogs for Ebola-specific immunoglobulin G antibodies by location
Figure 1

Locations of the main towns of Gabon (Libreville and Port Gentil) and the villages in the Ebola virus–epidemic area during the 2001–2002 outbreak in Gabon. The villages where human cases of Ebola infection were observed are indicated by 

Sampling

Sampling was conducted in 2 ways. 1) Dogs in Libreville and Port Gentil were sampled in a veterinary clinic. Blood was collected in 5-mL dry Vacutainers (VWR International, Fontenay-sous-bois, France), and serum was prepared by centrifugation. Serum specimens were stored at –20°C until they were sent to the Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF), Gabon, where they were stored at –80°C until testing. 2) Dogs from the Ebola virus–endemic area were sampled in the villages. An experienced veterinary team was located at Mekambo, where field laboratory facilities were set up; blood samples were collected on a daily basis in the vicinity of the village by using 5-mL dry Vacutainers and medetomidine anesthesia. The tubes were then transported to Mekambo each evening, and serum was decanted from whole blood. Serum samples were kept in liquid nitrogen in 1-mL aliquots at Mekambo until they were transported to CIRMF. Serum samples were then stored at –80°C until serologic testing, antigen detection, and RNA amplification were carried out.

Dog owners were interviewed on their pets’ activities (e.g., participation in hunting) and health history. The focus of the interviews was on potential Ebola virus–exposure events, including human cases that occurred in the village and among dog owners.

Laboratory Investigations

Ebola virus–specific immunoglobulin (Ig) G was detected by using a standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method as previously described (8). Briefly, Maxisorp plates (VWR International) were coated with Ebola virus–Z antigens diluted 1:1,000 in phosphate-buffered saline (PBS), overnight at 4°C. Control plates were coated with uninfected Vero cell culture antigens in the same conditions. Sera diluted 1:400 in 5% nonfat milk in PBS-Tween 20 (0.1%) were added to the wells and incubated overnight at 4°C. IgG binding was visualized by using a peroxidase-labeled anti-dog IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, USA) and the TMB detector system (Dynex Technologies, Issy-les-Moulineaux, France). Optical density (OD) was measured at 450 nm with an ELISA plate reader. For each sample we calculated the corrected OD as the OD of the antigen-coated well minus the OD of the corresponding control well. The cut-off value (CO) was calculated as follows: CO = M + 3σ, where M is the average of the corrected OD of the 102 negative controls from France, and σ is the standard deviation. Samples were considered positive when the corrected OD was above the cut-off.

Samples positive in these serologic assays were used for antigen detection (9) and for viral polymerase chain reaction (PCR) amplification (10). Three positive and 3 negative serum specimens were also used for virus isolation (9). Briefly, Maxisorp plates were coated with a cocktail of 7 monoclonal antibodies against Ebola virus–Z antigens; control plates were coated with normal mouse ascitic fluid produced from the parent myeloma cell line. Serum was then added to the wells, followed by hyperimmune rabbit Ebola polyvalent antiserum and then peroxidase-conjugated goat antibodies against rabbit IgG. The TMB Microwell peroxidase substrate system was used to measure OD. For the detection of viral mRNA, total RNA was isolated from serum with the QIAmp viral RNA kit (Qiagen, Courtaboeuf, France), and cDNA was synthesized from mRNA as previously described. Two pairs of degenerate primers corresponding to the L-gene of Ebola virus were used for 2 rounds of amplification, which yielded a 298-bp fragment.

Statistical Methods

Confidence intervals for proportions were calculated by using the Clopper and Pearson method (11). Statistical comparisons between seroprevalence rates according to the sampling area were performed by using the Fisher exact test. The Cochran-Armitage test was used as a trend test for proportions, after checking for the goodness-of-fit of the underlying linear model (12). All tests used a 0.05 significance level. Statistical analyses were performed by using R software (R Development Core Team; 13).

Results

A total of 439 blood samples from dogs were screened for Ebola virus–specific IgG. Two (2%) of the 102 blood samples from dogs living in France had detectable Ebola virus–reactive IgG (Table 2). Seven of the 79 dogs sampled in Libreville and Port Gentil (8.9% prevalence rate), 15 of the 99 dogs sampled in Mekambo (15.2% prevalence rate), and 40 of the 159 dogs sampled in villages located within the Ebola virus–epidemic area (25.2% prevalence rate) had detectable IgG to Ebola virus antigens (Table 2).

Table 2

Prevalence rates of Ebola-specific immunoglobulin G antibodies in pet dogs from different areas and villages

During the 2001–2002 Ebola outbreak in Gabon, human cases of Ebola virus infection appeared only in certain villages within the Ebola virus–epidemic area (Figure 1). The prevalence of Ebola virus-reactive IgG among dogs from the villages where humans cases occurred was 27.2%, compared to 22.4% among dogs from villages where no human cases were noted (Table 2). In some cases, hunters had brought back to the village an Ebola virus–infected animal carcass found in the forest. This carcass was the source of human infection in the village, and the disease then spread from human to human, both within the village and to other villages by population movement (Figure 1). Thus, only secondary human cases were observed in some villages, with no identified animal source. The prevalence rate among dogs from villages with both an animal source and human cases was as high as 31.8%, compared to 15.4% among dogs from villages with human cases but no identified animal source (Table 2).

The seroprevalence rate was significantly lower in France (2.0%) than in Gabon (Table 2). In particular, it was lower than in the 2 major towns (p = 0.043), in Mekambo (p = 0.001), and in the Ebola virus-epidemic area (p < 0.001). The seroprevalence rate in the major towns (8.9%) was significantly lower than that in the Ebola virus–epidemic area (p = 0.003). Using scores from 1 to 4 for the canine prevalence rates in France, major towns, Mekambo and Ebola virus–epidemic areas, we observed a significant positive trend of linear increase (Cochran-Armitage test: p < 0.0001) (Figure 2A).

Figure 2

Seroprevalence of Ebola virus in dogs sampled in different areas: A) France, major towns of Gabon, Mekambo (a town close to the disease-epidemic area) and villages in the epidemic area; B) France, major towns of Gabon, Mekambo, villages without human 

The seroprevalence rates in dogs increased linearly as the sampling area approached the sites of human cases, as confirmed by the highly significant Cochran-Armitage test for trends in proportions (p < 0.0001), which used a score of 1 for France, 2 for major towns, 3 for Mekambo, 4 for villages from the disease-epidemic area without human cases, and 5 for villages from the Ebola virus–epidemic area with human cases (Figure 2B). The result was confirmed when restricted to the 3 latter areas (p = 0.04).

In parallel, the seroprevalence rates in dogs increased linearly as the sampling area approached animal sources, as confirmed by a significant Cochran-Armitage test (p < 0.0001), using a score of 1 for France, 2 for major towns, 3 for Mekambo, 4 for villages where no animal source was observed (with or without human cases), and 5 for villages where an animal source was observed (with human cases) (Figure 2C). Again, the result was confirmed when restricted to the 3 latter areas (p = 0.01).

Neither Ebola virus antigens nor nucleotide sequences were detected in any of the positive or negative dog blood samples. We also failed to isolate the virus cells from 3 positive and 3 negative samples on Vero-E6.

Discussion

We investigated the potential involvement of domestic dogs in the occurrence or dissemination of Ebola virus hemorrhagic fever in humans. Based on a large serologic survey of dogs in the 2001–2002 Ebola outbreak area in Gabon, we found evidence that dogs can be infected by Ebola virus, a finding that raises important human health issues. The ELISA method was based on the use of Ebola virus–Z antigens. Although cross-reactions can occur with antibodies to other subtypes, the presence of these subtypes in our samples is unlikely because only the Zaire subtype circulates in the study area: all patients and nonhuman primates tested in this part of central Africa were infected by the Zaire subtype alone. The 2 positive dogs in France, an apparently Ebola virus–exempt part of the world, could be attributed to false-positive reactions due to the calculation of the positivity cut-off and the 1:400 serum dilution step used in the tests.

We found that 40 of 159 dogs living in the 2001–2002 Ebola virus–epidemic area had detectable Ebola virus–specific IgG, indicating either true infection or simple antigenic stimulation. All the tests were standardized at the 1:400 serum dilution, and most serum specimens had high OD values even at higher dilutions, confirming the specificity of the reactions. These data are consistent with observations we made during the different Ebola outbreaks that occurred in Gabon and the Republic of Congo in recent years. We observed that some dogs ate fresh remains of Ebola virus–infected dead animals brought back to the villages, and that others licked vomit from Ebola virus–infected patients. Together, these findings strongly suggest that dogs can be infected by Ebola virus, and that some pet dogs living in affected villages were infected during the 2001–2002 human Ebola virus outbreak. No circulating Ebola antigens or viral DNA sequences (tested for by PCR) were detected in either positive or negative serum specimens, and attempts to isolate virus from these samples failed. These findings indicate either old, transient Ebola infection of the tested dogs, or antigenic stimulation.

Symptoms did not develop in any of these highly exposed animals during the outbreak, a finding that tends to support antigenic stimulation, asymptomatic, or very mild Ebola virus infection. Wild animals, especially gorillas and chimpanzees, can also be infected by Ebola virus, but the infection is highly lethal and causes huge outbreaks and massive population declines (5,14). Other animals such as guinea pigs (15), goats (16), and horses (17) remain asymptomatic or develop mild symptoms after experimental infection, but Ebola virus infection has never been observed in these species in the wild. Thus, dogs appear to be the first animal species shown to be naturally and asymptomatically infected by Ebola virus. Asymptomatic Ebola infection in humans has also been observed during outbreaks (18) but is very rare. Although dogs can be asymptomatically infected, they may excrete infectious viral particles in urine, feces, and saliva for a short period before virus clearance, as observed experimentally in other animals. Given the frequency of contact between humans and domestic dogs, canine Ebola infection must be considered as a potential risk factor for human infection and virus spread. Human infection could occur through licking, biting, or grooming. Asymptomatically infected dogs could be a potential source of human Ebola outbreaks and of virus spread during human outbreaks, which could explain some epidemiologically unrelated human cases. Dogs might also be a source of human Ebola outbreaks, such as the 1976 Yambuku outbreaks in Democratic Republic of Congo (19), the 1995 Kikwit outbreak, some outbreaks that occurred in 1996 and 2004 in Gabon and Republic of Congo (5), and the 1976 (6), 1979 (20), and 2004 (21) outbreaks in Sudan, the sources of which are still unknown. Together, these findings strongly suggest that dogs should be taken into consideration during the management of human Ebola outbreaks. To confirm the potential human risk of Ebola virus–infected dogs, the mechanisms of viral excretion (i.e. body fluids and virus kinetics of excretion) should be investigated during experimental canine infection. This research would also offer insights into the natural resistance of dogs.

The canine seroprevalence rates in Libreville and Port Gentil, the 2 main towns of Gabon, were significantly higher than that observed in France, which suggests antigenic stimulation in these towns where no cases of Ebola infection have been observed. Epidemiologic investigations showed that most seropositive dogs in Libreville and Port Gentil had probably never had contact with an infected source (dead animal or human case-patient), and that they had never visited the Ebola virus–epidemic area, in theory ruling out true infection. They may therefore have come into contact with free viral antigens, transmitted by aerosol or, to a lesser extent, experienced conjunctival exposure to virus-laden droplets of urine, feces, or blood of the unknown natural host. Ebola virus has been shown to be experimentally transmissible to rhesus monkeys by inhalation (22) and conjunctival exposure (23). Moreover, accidental transmission of Ebola virus to 2 rhesus monkeys that had no direct contact with experimentally infected monkeys was observed in a biocontainment laboratory, which also suggests aerosol, conjunctival, or oral transmission (24).

The Ebola virus reservoir species appears to extend throughout central Africa, both in rural and urban areas and might therefore be a small terrestrial mammal or a bird. No good candidate species has yet been identified, despite extensive studies (25,26). Epidemiologic observations during the 1976 outbreaks in Democratic Republic of Congo and Sudan identified bats as a potential reservoir (6,20), and Ebola virus nucleotide sequences and Ebola virus–like virus capsids were detected in rodents in the Central African Republic (27). The discovery of Ebola virus–positive pet dogs in undeclared affected areas suggests that these animals live in close contact with the Ebola virus reservoir, and this finding should help to narrow the search.

One striking result of this study is the significant increasing gradient of canine seroprevalence from France to the Ebola virus–epidemic area, including from villages with and without human cases in the area. The Cochran-Armitage test for trends in proportions showed that seroprevalence increased linearly from France (2%), to major towns (8.9%), then to Mekambo (15.2%), and then to villages in the Ebola virus–epidemic area (25.2%). This trend is supported by the increasing seroprevalence as the sampling area approached human cases and animal sources (Cochran-Armitage test, p < 0.0001). These findings suggest that canine seroprevalence could reflect contact with the virus and, thus, virus activity in a given area and also the risk for human infection.

The virus appears to jump from its natural host to humans only in specific, but unknown, conditions. Seroprevalence rates in dogs might serves as an indicator of Ebola virus in regions in which no animal deaths or human cases have been observed.

In conclusion, this study offers the first evidence that dogs might be asymptomatically infected by Ebola virus in the wild. This finding has potential implications for preventing and controlling human outbreaks. The increasing canine seroprevalence gradient from low-risk to at-risk Ebola virus–endemic areas indicates that this seroprevalence might be used as an epidemiologic indicator of virus circulation in regions where no other means of virus detection are available.

Acknowledgments

We thank T. G. Ksiazek and P. E. Rollin, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA, for their assistance with IgG assays and for providing Ebola-specific reagents. We also thank all those involved in sample collection and case reporting: veterinarians Philippe Sarrazin, Loïc Delestre, Brigitte Siliart, and Marie-Pierre Vandenbroucke.

CIRMF is supported by the Government of Gabon, Total-Fina-Elf Gabon, and the Ministère de la Coopération Française. This work was also supported by a Fonds de Solidarité Prioritaire grant from the Ministère des Affaires Etrangères de la France (FSP no. 2002005700).

Biography

Loïs Allela is veterinary inspector with the Ministry of Environment of Gabon. Her current research focuses on Ebola virus infection in dogs.

Footnotes

Suggested citation for this article: Allela L, Bourry O, Pouillot R, Délicat A, Yaba P, Kumulungui B, et al. Ebola virus in dogs and human risk. Emerg Infect Dis [serial on the Internet]. 2005 Mar [date cited].http://dx.doi.org/10.3201/eid1103.040981

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