La exposición continua a campos electromagnéticos LTE de 1,7 GHz aumenta las especies de oxígeno reactivo intracelular para disminuir la proliferación de células humanas e inducir la senescencia | Reporte cientifico

Resumen

Debido al rápido desarrollo de la tecnología de los teléfonos móviles, estamos continuamente expuestos a campos electromagnéticos de radiofrecuencia (RF-EMF) LTE de 1,7 GHz, pero sus efectos biológicos no se han aclarado. Aquí, investigamos los efectos celulares no térmicos de estos RF-EMF en células humanas, incluidas las células madre derivadas de tejido adiposo humano (ASC), las células madre de cáncer de hígado Huh7 y Hep3B (CSC), las células cancerosas HeLa y SH-SY5Y, y células normales de fibroblastos IMR-90. Cuando se expuso continuamente a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 1 y 2 SAR, la proliferación celular disminuyó consistentemente en todas las células humanas. El efecto antiproliferativo fue mayor a 2 SAR que a 1 SAR y fue menos grave en las ASC. La exposición a RF-EMF durante 72 ha 1 y 2 SAR no indujo roturas de doble cadena de ADN o muerte celular apoptótica. pero desencadenó un ligero retraso en la transición del ciclo celular G1 a S. La senescencia celular también se observó claramente en células ASC y Huh7 expuestas a RF-EMF a 2 SAR durante 72 h. El ROS intracelular aumentó en estas células y el tratamiento con un eliminador de ROS recapituló el efecto antiproliferativo de RF-EMF. Estas observaciones sugieren fuertemente que 1.7 GHz LTE RF-EMF disminuyen la proliferación y aumentan la senescencia al aumentar las ROS intracelulares en las células humanas.

Introducción

El desarrollo de la tecnología de comunicación inalámbrica ha hecho que nuestra vida sea eficiente y conveniente. A cambio, estamos continuamente expuestos a campos electromagnéticos de radiofrecuencia (RF-EMF) y la exposición ambiental a RF-EMF ha aumentado constantemente. La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) clasificó los campos electromagnéticos de radiofrecuencia como carcinógenos del Grupo 2B en 2011 1 , 2 . Sin embargo, los estudios biológicos no han respaldado ni aclarado de manera consistente el efecto cancerígeno de RF-EMF. Una revisión de 2012 sugirió que los datos actualmente disponibles no mostraron efecto genotóxico de RF-EMF 3 . Dos estudios recientes en animales realizados por el Programa Nacional de Toxicología de EE. UU. 4 , 5 y el Instituto Ramazzini 6investigó el potencial carcinogénico de la exposición a largo plazo a RF-EMF asociados con teléfonos móviles. La Comisión Internacional de Protección contra la Radiación No Ionizante (ICNRP) evaluó estos dos informes y recientemente anunció que las conclusiones sobre el potencial carcinogénico de los RF-EMF no podían extraerse debido a las limitaciones técnicas de los estudios 7 . Por otro lado, un informe reciente mostró que las ratas expuestas desde la vida prenatal hasta la muerte natural al sistema global de 1.8 GHz para la comunicación móvil (GSM) aumentaron la incidencia de schwannoma maligno del corazón entre los machos expuestos a la dosis más alta 8 . Por lo tanto, los efectos cancerígenos de RF-EMF aún no están claros.

Actualmente, los RF-EMF de 1700 a 1950 MHz son las frecuencias más utilizadas en las comunicaciones móviles. Varios estudios han demostrado que RF-EMF de 1800 MHz no indujo daño en el ADN o comportamientos celulares anormales en células neurogénicas humanas, fibroblastos de la piel y células madre hematopoyéticas 9 , 10 , 11 . Por otro lado, algunos estudios informaron el efecto adverso de 1800 MHz en las células madre neurales embrionarias de ratón y las alteraciones del perfil de expresión génica en las neuronas de rata 12 , 13 . La radiación de 1800 MHz también indujo daños en células germinales inmortalizadas de ratón y espermatozoides in vitro 14. Se ha informado que la exposición a 1800 MHz RF induce daño oxidativo en el ADN mitocondrial y las funciones celulares de las células neurogénicas humanas cultivadas y las células epiteliales del cristalino 15 , 16 . Estas inconsistencias pueden deberse a diferencias en los dispositivos de exposición, las condiciones de exposición o la fuente de las células. Además, la tecnología de comunicación inalámbrica reciente está utilizando la evolución a largo plazo de la comunicación de cuarta generación (4G-LTE), que proporciona velocidades de Internet muy rápidas sobre las frecuencias de radio utilizadas actualmente. Sin embargo, los efectos celulares de LTE RF-EMF en varias células humanas aún no han sido bien documentados.

El impacto fisiológico de la RF en tejidos o células implica efectos térmicos y no térmicos 17 . Los estudios en RF-EMF de 900 MHz han propuesto que el calor, la generación de ROS, la interrupción de la homeostasis del calcio y los cambios en la expresión génica son los principales mecanismos involucrados en los efectos biológicos de los campos electromagnéticos 18 , 19 , 20 , 21 .

En este estudio, investigamos los efectos no térmicos de 1.7 GHz LTE RF-EMF en el crecimiento de varias células humanas, incluidas las células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), las poblaciones de células madre de cáncer de hígado (CSC) de Huh7 y Hep3B, el neuroblastoma SH-SY5Y, el cáncer cervical HeLa y las células normales de fibroblastos IMR-90. Teniendo en cuenta los valores de exposición máximos permitidos actuales (2 W / kg en Europa y 1,6 W / kg en los EE. UU.) 22 , probamos el efecto de LTE RF-EMF de 1,7 GHz a 1 W / kg (SAR) y 2 W / kg.

Resultados

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF disminuyó la proliferación celular humana

Los dispositivos de exposición electromagnética no están comercialmente estandarizados y, en general, se fabrican en diversas formas, según el propósito del estudio 23 . Diseñamos un dispositivo estructurado RTL en este estudio, y la información detallada sobre el dispositivo se describió en Materiales y Métodos (Figs.  1 y 2 ). Nuestro objetivo de este estudio fue investigar el efecto no térmico de 1.7 GHz LTE RF-EMF. Por lo tanto, tratamos de minimizar el efecto térmico instalando un sistema de refrigeración por agua refrigerada forzada en la incubadora conectada a la antena que genera LTE RF-EMF de 1.7 GHz (Fig.  2) Con el fin de investigar el efecto celular no térmico de 1.7 GHz LTE RF-EMF en varias células humanas, incubamos continuamente ASC, una población de CSC hepático de células cancerosas Huh7 y Hep3B, HeLa y SH-SY5Y, y fibroblastos normales IMR-90 células durante 72 h en un LTE RF-EMF de 1.7 GHz a 1 y 2 SAR, respectivamente.

Figura 1
Figura 1

Diseño del sistema de exposición celular LTE RF-EMF de 1.7 GHz. ( A ) Un diagrama esquemático del sistema de exposición de la línea de transmisión radial (RTL). ( B ) Vista en sección transversal de la cámara de exposición RTL. ( C ) Características de pérdida de retorno de la cámara de exposición RTL. ( D ) Antena y los puntos de medición en cada placa de cultivo. ( E ) Temperatura y ajuste lineal para el punto central en la frecuencia LTE 1.7 GHz. La temperatura se midió sin circulación de agua durante la exposición a RF.

Figura 2
Figura 2

Dispositivo de exposición celular LTE RF-EMF de 1.7 GHz y su sistema de refrigeración por agua. ( A ) Se utilizó el dispositivo de exposición celular LTE RF-EMF de 1.7 GHz. ( B ) Un sistema de enfriamiento de agua para que la incubadora reduzca por la fuerza la temperatura del agua calentada en 1.7 GHz RF-EMF. ( C ) La cámara de la incubadora con una antena LTE RF-EMF de 1.7 GHz. ( D ) Una placa para platos de cultivo celular en ( C ) se encuentra a 13,6 cm de la antena cónica en el centro de la cámara de exposición. ( E ) Un diagrama de ( D ) que designa la posición de los platos celulares para una exposición SAR precisa. ( F) La tabla de conversión SAR para este dispositivo de exposición RF-EMF. Los valores de SAR para condiciones de exposición precisas se obtuvieron mediante cálculos de ingeniería. ( G ) El eje X en los gráficos superior e inferior representa el tiempo real en el que el RF-EMF está expuesto a las células. El eje Y en el gráfico superior representa el valor SAR (Watt) de RF-EMF durante la exposición. El eje Y en el gráfico inferior muestra la temperatura de la incubadora (línea amarilla) y la temperatura del sistema de refrigeración por agua refrigerada (línea roja) del dispositivo de exposición RF-EMF durante el experimento.

Cuando examinamos por primera vez el efecto celular de 1.7 GHz LTE RF-EMF a 1 y 2 SAR en ASC y Huh7, la proliferación celular de ASC y Huh7 disminuyó (Fig.  3A ). En comparación con el control no expuesto, la proliferación de ASC disminuyó 12% a 1 SAR y 54% a 2 SAR (Fig.  3A, B ). El efecto antiproliferativo de 1.7 GHz LTE RF-EMF fue más severo en Huh7 que en ASC: 21% a 1 SAR y 73% a 2 SAR (Fig.  3B) Estos resultados mostraron que el efecto antiproliferación de 1.7 GHz LTE RF-EMF fue más grave a 2 SAR que a 1 SAR. Para confirmar el efecto antiproliferativo de 1.7 GHz LTE RF-EMF en células humanas en general, también examinamos la proliferación de células Hep3B, otro tipo de población de CSC hepático, células de cáncer uterino HeLa, células de neuroblastoma SH-SY5Y y fibroblastos normales Células IMR90, después de que las células fueron expuestas a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 1 SAR y 2 SAR. Al igual que con Huh7, la proliferación de estas células disminuyó en aproximadamente 30 ~ 35% a 1 SAR y 49 ~ 88% a 2 SAR (Fig.  4) Curiosamente, notamos que las células de neuroblastoma SH-SY5Y eran notablemente más sensibles a 1.7 GHz LTE RF-EMF a 2 SAR que las otras células examinadas. Estos resultados demostraron que la exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 h disminuyó constantemente la proliferación de células cancerosas y normales, independientemente de su tejido de origen. Además, los ASC no eran tan sensibles como otros tipos de cáncer y células normales a la exposición a LTE RF-EMF de 1.7 GHz.

figura 3
figura 3

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF disminuyó la proliferación celular ASC y Huh7. ( A, B ) Las células ASC y Huh7 preparadas como se describe en Materiales y Método fueron expuestas a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 1 SAR ( A ) o 2 SAR ( B ). Las células de control simulado se incubaron durante 72 h sin exposición a RF-EMF. Después de la exposición, se recogieron las células y se contaron con un contador celular (Nexcelom Bioscience). Se realizaron tres experimentos independientes y el número de células se representó como media ± DE P <0.01 (**), P <0.001 (***) y P> 0.05 (no significativo, ns).

Figura 4
Figura 4

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF disminuyó la proliferación de varias células humanas. ( A, B ) Las células Hep3B, HeLa, SH-SY5Y e IMR 90 fueron expuestas a LTE 1.7 GHz RF-EMF durante 72 ha 1 SAR ( A ) o 2 SAR ( B ). Las células de control simulado se incubaron durante 72 h sin exposición a RF-EMF. Después de la exposición, las células se recogieron y contaron con un contador celular (Nexcelom Bioscience). Se realizaron al menos tres experimentos independientes y los números de células se representaron como media ± DE P <0.01 (**), P <0.001 (***) y P> 0.05 (no significativo, ns).

1.7 GHz LTE RF-EMF no indujo daño en el ADN y muerte celular apoptótica

Nos centramos especialmente en estudiar el mecanismo del efecto antiproliferativo en las ASC y en una población de CSC de Huh7 porque las ASC mostraron ser las menos sensibles entre las células humanas examinadas, mientras que las células Huh7 fueron muy sensibles al LTE RF-EMF de 1.7 GHz, como se muestra en las Figs. 3 – 4 . Las funciones fisiológicas clave de las ASC como las células madre adultas del linaje mesenquimatoso que pueden aislarse fácilmente del cuerpo y diferenciarse en varios tipos de células para ser utilizadas en la terapia con células madre también nos atrajeron para estudiar el efecto de la LTE RF-EMF de 1.7 GHz en las ASC 20 . También nos interesó el efecto antiproliferativo de LTE RF-EMF de 1.7 GHz en las CSC de Huh7 porque las CSC desempeñan papeles fundamentales en la formación y recurrencia del cáncer 24 , 25 ,26 . Huh7 es una línea celular de carcinoma derivado de hepatocitos y sus poblaciones de células madre se aíslan utilizando los marcadores, CD133 y la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) 27 , 28 .

Para entender si la disminución en la proliferación celular causada por el LTE RF-EMF de 1.7 GHz se debió al daño del ADN y la muerte celular, examinamos si el LTE RF-EMF de 1.7 GHz induce roturas de doble cadena de ADN (DSB) y apoptosis en ASCs y Huh7 . Detectamos la expresión de fosfo-histona 2AX (γ-H2AX) como un marcador de ADN DSB y la polimerasa de poli ADP-ribosa escindida (PARP) como un marcador de apoptosis con transferencias Western, después de que ASCs y Huh7 se expusieron a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 1 SAR. Las células ASC y Huh7 tratadas con UV o doxorrubicina se usaron como control para los ADN DSB y la muerte celular apoptótica. Los DSB de ADN y la PARP escindida no se observaron en ASC o Huh7 expuestos a LTE RF-EMF de 1.7 GHz durante 72 ha 1 SAR, mientras que pudimos detectar γ-H2AX y PARP escindido en células Huh 7 tratadas con UV (Fig.  5A, si) Teniendo en cuenta que el efecto antiproliferativo se vuelve más severo cuando las células fueron expuestas a 2 SAR de 1.7 GHz LTE RF-EMF (Fig.  3 ), también examinamos la expresión de γ-H2AX y PARP escindido a 2 SAR. Sin embargo, γ-H2AX y PARP escindido no se detectaron incluso en células ASC y Huh7 expuestas a 2 SAR (Fig.  5C, D ). Estas observaciones sugieren fuertemente que la disminución de la proliferación celular no fue causada ni por el daño del ADN ni por la muerte celular apoptótica. Curiosamente, de acuerdo con muchos informes de que las células madre adultas no eran tan sensibles a diversos tipos de estrés como otras células 29 , las ASC tratadas con UV no mostraron ningún γ-H2AX o PARP escindido. Las ASC mostraron débil γ-H2AX y PARP escindido cuando se trataron con doxorrubicina, que se usó como control.

Figura 5
Figura 5

La exposición continua a LTE RF-EMF a 1.7 GHz no indujo daño en el ADN y apoptosis celular en células ASC y Huh7. ( A – D ) Las células ASC y Huh7 se expusieron continuamente a LTE RF-EMF a 1,7 GHz durante 72 horas a 1 SAR ( A, B ) o 2 SAR ( C, D ) y se recogieron. Las células se lisaron con tampón de lisis y se extrajeron las histonas, que se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 8-15% (PAGE) para análisis occidentales. Las transferencias Western se realizaron con ( A, C ) anticuerpos anti γ-H2AX y anti-histona H3, ( B, D ) anticuerpos anti-PARP y actina. Las células expuestas a UV o tratadas con doxorrubicina 3 μM (DOX) se usaron como controles positivos para el daño del ADN y la apoptosis. ( A, C ) Histona H3 y ( B, D) Se utilizó β-actina de la misma transferencia como control de carga. Se realizaron más de tres réplicas independientes de todos los experimentos. Las manchas / geles de longitud completa originales se presentaron en la Información complementaria.

1.7 GHz LTE RF-EMF disminuyó la proliferación celular al inducir la senescencia celular

Después de confirmar que la disminución de la proliferación celular causada por el LTE RF-EMF de 1.7 GHz no se debió directamente al daño del ADN y la muerte celular, examinamos si la disminución de la proliferación celular se debería a la senescencia celular, lo que ralentiza la progresión del ciclo celular y disminuye el crecimiento celular . Por lo tanto, analizamos la actividad de la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA) en células ASC y Huh7 expuestas a 1.7 LTE GHz RF-EMF durante 72 ha 1 y 2 SAR. ASC y células Huh7 tratadas con peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) también se tiñeron con SA-β-gal como control positivo para la senescencia celular. En comparación con las células no tratadas con RF, la exposición a LTE RF-EMF a 1 SAR aumentó el número de células teñidas con SA-β-gal solo en un 2% en ASC y en un 4% en Huh7, mientras que H 2 O 2el tratamiento aumentó el número de células SA-β-gal-positivas tanto en el ASC como en Huh7 en más del 50% (Fig.  6A ). Cuando se expusieron a 2 SAR de 1,7 GHz LTE RF-EMF, las células teñidas con SA-β-gal aumentaron ligeramente al 3% en las ASC y aumentaron mucho al 42% en las células Huh7, en comparación con el control no tratado (Fig.  6B ) . El aumento en las células positivas para la senescencia es consistente con la observación de que el efecto antiproliferativo de 2 SAR se vuelve más severo que el de 1 SAR y que las células Huh7 son más sensibles que las ASC.

Figura 6
figura6

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF indujo senescencia celular en células ASC y Huh7. ( A, B ) ASC y células Huh7 expuestas a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 1 SAR (A) o 2 SAR ( B ). Las células se fijaron en formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2%, y se incubaron con 0,1% de X-gal durante 30 h. ASCs tratados con 200? M H 2 O 2 durante 1 h y las células Huh7 tratadas con 300 mM H 2 O 2durante 2 h se usaron respectivamente como control positivo. Las imágenes se tomaron con un microscopio Nikon (ECLIPSE Ts2) con un objetivo de 10 ×. Barra de escala, 50 μm. Se contaron un total de 200 células para cada experimento. Los porcentajes son células positivas para SA-β-gal sobre el total de células contadas. El experimento se realizó por triplicado y el porcentaje de células se representó como media ± DE P <0.05 (*), P <0.01 (**) y P> 0.05 (no significativo, ns). ( C – E ) Las células Huh7 expuestas a LTE RF-EMF a 1,7 GHz ( B ) se sometieron a transferencias Western con ( C ) anti-p21, ( D ) anti-fosforado-p53 en Ser15 y anti-p53, ( E) anti-Rb y anti-fosforilado-Rb en ​​Ser 780. Se usó β-actina de la misma transferencia como control de carga. Se realizaron más de tres réplicas independientes para todos los experimentos. Los borrones completos originales se presentaron en la Información complementaria.

Luego detectamos marcadores moleculares de senescencia celular en células Huh7 expuestas a LTE RF-EMF de 1.7 GHz durante 72 ha 2 SAR, ya que las células Huh7 eran más sensibles que las ASC y la expresión de marcadores de senescencia sería obvia. La expresión aumentada de p21, el aumento de la fosforilación de p53 en la serina 15 y la disminución de la fosforilación del retinoblastoma (Rb) en la serina 780 se han informado como marcadores de detención del ciclo celular asociados con la senescencia 30 , 31 . Por lo tanto, examinamos la expresión de estos marcadores en células Huh7 expuestas a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 2 SAR. La expresión de p21 aumentó, mientras que apenas se detectó en las células de control no expuestas (Fig.  6C) Al igual que en el caso de las células de senescencia de control positivo tratadas con peróxido de hidrógeno, los niveles de fosforilación de Ser 15, así como la cantidad total de p53 en las células Huh7 expuestas, fueron ligeramente más altas que en las del control no expuesto (Fig.  6D ). La expresión de Rb fosforilada en Ser 780 fue fuerte en el control no expuesto, pero disminuyó notablemente en las células Huh7 expuestas a 1.7 GHz LTE RF-EMF y no se detectó en las células de senescencia de control positivo tratadas con peróxido de hidrógeno (Fig.  6E ). La cantidad total de Rb en ​​las células Huh7 expuestas fue similar a la de las células de control positivo y negativo (Fig.  6E) Las expresiones de estos marcadores moleculares para la senescencia celular apoyan firmemente la noción de que la exposición a LTE RF-EMF de 1.7 GHz disminuye la proliferación al inducir la senescencia celular.

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF retrasó la progresión del ciclo celular en G1 / S

Luego examinamos el contenido de ADN de ASC y células Huh7 expuestas a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 h por citometría de flujo para confirmar que la exposición no indujo la muerte celular sino la senescencia celular. De acuerdo con los resultados de la transferencia de Western que se muestran en la Fig.  5 , no se detectó población sub G1 en las células ASC o Huh7 en 1 o 2 SAR, lo que confirma que el LTE RF-EMF de 1.7 GHz no indujo la muerte celular (Fig.  7 ). Tampoco observamos cambios significativos en el ciclo celular de las ASC expuestas a 1 SAR (Fig.  7A ). Las células Huh7 expuestas a 1 SAR mostraron poblaciones de G1 ligeramente aumentadas y S disminuidas en comparación con las células de control no expuesto (Fig.  7A) Curiosamente, cuando se expuso a 2 SAR de 1.7 GHz RF-EMF, pudimos observar claramente el retraso del ciclo celular en la progresión G1 / S en células Huh7: la población G1 aumentó un 6% y la población S disminuyó un 6% en comparación con los no expuestos control (Fig.  7B ). Estas observaciones fueron consistentes con la activación de p21 y p53 en las células Huh7 se expone a 2 SAR de 1,7 GHz RF-EMF, como se muestra en la Fig.  6C, D . Además, también pudimos observar un ligero retraso en el ciclo celular en la progresión G1 / S en ASC expuestas a 2 SAR de 1.7 GHz RF-EMF (Fig.  7B ). Los resultados en las Figs. 6 , 7demostró que más células mostraron un retraso del ciclo celular en la tinción positiva G1 / S y SA-β-gal cuando la SAR se incrementó de 1 a 2, lo que respalda nuestra noción de que el efecto antiproliferación de RF-EMF estaba directamente relacionado con la célula retraso del ciclo y senescencia celular. También confirmamos el retraso del ciclo celular y la senescencia celular con la exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF utilizando marcadores moleculares bien conocidos para el retraso del ciclo celular G1 a S. En conjunto, estas observaciones demostraron fuertemente que la exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF indujo un retraso del ciclo celular en la transición y senescencia G1 / S, causando el efecto antiproliferativo.

Figura 7
figura7

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF indujo el retraso del ciclo celular en la fase G1 en las células ASC y Huh7. ( A – B ) Las células ASC y Huh7 se expusieron a RF-EMF de 1.7 GHz durante 72 ha 1 SAR ( A ) o 2 SAR ( B ). El contenido de ADN de las células de control simulado RF-EMF expuestas a 1,7 GHz y no expuestas se analizó por citometría de flujo (BD Bioscience) después de la tinción con PI. Se contaron 100.000 células para cada experimento. Los resultados de FACS se analizaron usando el software Flowing 2 y la distribución de células en cada etapa del ciclo celular se calculó a partir de los resultados de FACS que se muestran en el panel izquierdo usando el software Flowing 2. P <0.05 (*), P <0.01 (** ), P <0,001 (***) y P> 0,05 (no significativo, ns).

Las ROS generadas por 1.7 LTE GHz RF-EMF son responsables del efecto antiproliferativo

Cuando cuestionamos cómo la senescencia celular inducida por LTE RF-EMF a 1,7 GHz, examinamos si la ROS intracelular aumentó en las células ASC y Huh7 por la exposición a LTE RF-EMF a 1,7 GHz y si la disminución de la proliferación de células ASC y Huh7 se debió a la ROS generada por RF-EMF. Primero, examinamos las ROS intracelulares en las células ASC y Huh7 expuestas a LTE RF-EMF de 1.7 GHz con un marcador fluorogénico de ROS, carboxi-H 2 DCFDA. Las células Huh7 y las ASC tratadas con hidroperóxido de terc-butilo (TBHP) se usaron como control positivo para una mayor generación de ROS intracelular. Cuando estas células se expusieron a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 h a 2 SAR, en el que el efecto antiproliferativo era obvio (Fig.  8A, C ), tanto las células Huh7 como las ASC mostraron un aumento de carboxi-H2 .DCFDA tinción en comparación con las células de control no expuestos (Fig.  8B, D ). También observamos que carboxi-H 2 DCFDA tinción era más brillante en las células Huh7 que en ASCs, lo cual es consistente con el efecto anti-proliferativa más fuerte en las células Huh7 que en ASC.

Figura 8
figura 8

La exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF disminuyó la proliferación celular al inducir ROS intracelular en células ASC y Huh7. ( A – D ) Las células ASC y Huh7 pretratadas o no con NAC 100 μM se expusieron a RF-EMF a 1,7 GHz durante 72 ha 2 SAR, mientras que las células de control simulado se incubaron durante 72 h sin exposición a RF-EMF. Después de la exposición, ( A, C ) las células se recogieron y se contaron con un contador celular (Nexcelom Bioscience). Células Huh7 ( B ) y ASC ( D ) se tiñeron con carboxi-H 2 DCFDA. Las células tratadas con TBHP se usaron como control positivo para la generación intracelular de ROS. Las células ( E, F ) ASC y Huh7 se expusieron a RF-EMF a 1,7 GHz durante 72 ha 1 SAR o 2 SAR, y se tiñeron con MitoSOX. (B, D – F ) Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342. Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Axioplan2 (Zeiss) bajo un objetivo de 200x. Barra de escala, 25 μm. Todos los experimentos consistieron en tres réplicas independientes.

Confirmamos además la observación de que la exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF aumentó ROS intracelular en ASC y células Huh7 por tinción con MitoSOX Red. MitoSOX Red permite la visualización selectiva de O 2 •  generado en las mitocondrias, ya que solo se oxida rápidamente por O 2 • – 32 . Pudimos detectar claramente la tinción brillante de MitoSOX en células Huh7 y ASC expuestas a RF-EMF y la tinción fue mucho más brillante en 2 SAR que en 1 SAR (Fig.  8E, F ). Estas observaciones sugirieron fuertemente que 1.7 GHz LTE RF-EMF disminuye la proliferación celular al aumentar las ROS intracelulares en las células humanas.

Para confirmar que la disminución de la proliferación de células ASC y Huh7 después de la exposición a 2 SAR de LTE RF-EMF de 1.7 GHz fue atribuible a las ROS intracelulares generadas por RF-EMF, comparamos la viabilidad de las células ASC y Huh7 con y sin exposición a 1.7 GHz LTE RF-EMF en presencia y ausencia de un antioxidante. Utilizamos N-acetilcisteína (NAC) como un eliminador de ROS. Si la ROS intracelular es responsable de la disminución de la proliferación, la viabilidad celular aumentaría en presencia de NAC. Como se informó anteriormente, el tratamiento con NAC 100 μM aumentó la proliferación de células Huh7 no expuestas a RF-EMF y ASC en un 9% y 12%, respectivamente, debido a su efecto antioxidante 33 , 34.. Curiosamente, cuando tanto las células Huh7 como las ASC se pretrataron con NAC, el número de células aumentó en un 49% en Huh7 y un 42% en las ASC después de la exposición a 1.7 GHz RF-EMF / LTE durante 72 ha 2 SAR, en comparación con el células expuestas solo a RF-EMF sin NAC (Fig.  8A, C ). Estos resultados demostraron que el pretratamiento con el NAC antioxidante fue mucho más efectivo para restaurar la proliferación en células ASC y Huh 7 expuestas a LTE RF-EMF de 1.7 GHz que para aumentar la proliferación en las células no expuestas (Fig.  8A, C ). De acuerdo con la restauración de la proliferación, la tinción intracelular de ROS disminuyó significativamente en las células ASC y Huh7 pretratadas con NAC antes de la exposición a 2 SAR de LTE RF-EMF a 1,7 GHz, en comparación con las células expuestas a RF-EMF sin pretratamiento ( Higo. 8B, D ). Estos resultados sugirieron fuertemente que los ROS intracelulares generados por 1.7 LTE GHz RF-EMF juegan un papel clave en la disminución de la proliferación de varias células humanas, incluidas ASC y Huh7.

Discusión

Recientemente, los EMF RF de 1700 a 1950 MHz se han convertido en las frecuencias más utilizadas en comunicaciones móviles y se han realizado algunos estudios para investigar cómo la exposición a estas frecuencias de EMF RF afecta a los organismos vivos. Sin embargo, los tipos y condiciones de exposición en los estudios fueron diferentes y los resultados no fueron consistentes 11 , 12 , 21 , 35 , 36 . Teniendo en cuenta que el LTE RF-EMF de 1.7 GHz se utiliza principalmente en la comunicación inalámbrica, muchas investigaciones se han centrado en cerebros o nervios que están expuestos a equipos de comunicación inalámbrica 37 , 38.. Sin embargo, para comprender los resultados fisiológicos y sus mecanismos de 1.7 LTE GHz RF-EMF, se necesitan estudios de su efecto en varias células humanas. En este estudio, desarrollamos un dispositivo generador de RF-EMF para minimizar el efecto térmico e investigamos el efecto celular no térmico de 1.7 GHz LTE RF-EMF en varias células humanas, incluidas las células madre derivadas de tejido adiposo humano, células madre de cáncer de hígado poblaciones de células cancerosas Huh7 y Hep3B, HeLa y SH-SY5Y, y células IMR-90 de fibroblastos normales. Demostramos que la exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF durante 72 ha 1 y 2 SAR disminuyó la proliferación celular en todos los tipos de células estudiados, independientemente de si eran células cancerosas o normales o su tejido de origen. También demostramos que los efectos anti-proliferación de 1. El LTE RF-EMF de 7 GHz se correlacionó directamente con el aumento del valor SAR cuando el valor SAR aumentó de 1 a 2. El efecto antiproliferativo inducido por RF-EMF fue menos severo en las ASC, un tipo de células madre adultas mesenquimatosas, que es consistente con las observaciones bien conocidas de que las células madre son en general menos sensibles a diversas tensiones. Una observación interesante fue que las células SH-SY5Y de origen neural fueron las más sensibles entre los tipos de células estudiadas en 2 SAR. Si las células neurales en general son más sensibles a la LTE RF-EMF de 1.7 GHz que otros tipos de células, se debe estudiar más a fondo, ya que los cerebros y los nervios están directamente expuestos al equipo de comunicación inalámbrico. lo cual es consistente con las observaciones bien conocidas de que las células madre son en general menos sensibles a diversas tensiones. Una observación interesante fue que las células SH-SY5Y de origen neural fueron las más sensibles entre los tipos de células estudiadas en 2 SAR. Si las células neurales en general son más sensibles a la LTE RF-EMF de 1.7 GHz que otros tipos de células, se debe estudiar más a fondo, ya que los cerebros y los nervios están directamente expuestos al equipo de comunicación inalámbrico. lo cual es consistente con las observaciones bien conocidas de que las células madre son en general menos sensibles a diversas tensiones. Una observación interesante fue que las células SH-SY5Y de origen neural fueron las más sensibles entre los tipos de células estudiadas en 2 SAR. Si las células neurales en general son más sensibles a la LTE RF-EMF de 1.7 GHz que otros tipos de células, se debe estudiar más a fondo, ya que los cerebros y los nervios están directamente expuestos al equipo de comunicación inalámbrico.

También demostramos que el efecto antiproliferativo de la exposición continua a 1.7 GHz LTE RF-EMF fue inducido por la senescencia celular y no por el daño del ADN y la apoptosis. De hecho, no se detectaron DSB de ADN obvios ni activación de apoptosis en las células expuestas. Más bien, demostramos que la disminución de la proliferación celular inducida por la exposición a 1.7 GHz LTE RF-EMF se debió a un ligero retraso del ciclo celular en la transición de fase G1 a S y la activación de la senescencia celular.

La pregunta clave era entonces, cómo la exposición a 1.7 GHz LTE RF-EMF induce su efecto antiproliferativo en las células humanas. Mostramos en este estudio que la exposición a LTE RF-EMF de 1.7 GHz aumenta las ROS intracelulares y que la generación de ROS intracelulares está directamente correlacionada con la SAR; se generó más ROS cuando el SAR aumentó de 1 a 2. Cabe destacar que detectamos una generación significativamente mejorada de ROS en las mitocondrias de las células expuestas a LTE RF-EMF de 1.7 GHz, lo que sugiere que la exposición a RF-EMF afecta la eficiencia del electrón sistema de transporte de mitocondrias. Se necesitarían más estudios para comprender cómo RF-EMF afecta el sistema de transporte de electrones y la tasa de generación de ROS en las mitocondrias.

Si bien el aumento de la generación de ROS en concierto con la exposición a 1.7 GHz LTE RF-EMF en células humanas se correlaciona con el efecto antiproliferativo de RF-EMF, puede no ser una evidencia directa. Para verificar que el aumento de ROS es una causa directa del efecto antiproliferativo de RF-EMF, preincubamos las células con el NAC antioxidante antes de exponerlas al RF-EMF. Observamos que el antioxidante podría recuperar no solo las ROS intracelulares sino también la disminución de la proliferación, lo que sugiere fuertemente que las ROS son las principales responsables del efecto antiproliferativo de 1.7 GHz LTE RF-EMF.

Varios estudios que examinaron el efecto de 1.8 GHz RF-EMF, un rango de frecuencia similar al que usamos, también han reportado resultados antiproliferativos consistentes como el efecto de 1.7 GHz LTE RF-EMF de este estudio. Ni y col . informó que la exposición de las células epiteliales de la lente humana a RF-EMF a 1.8 GHz a 2, 3 y 4 SAR, cada una durante 6, 12 y 24 h, aumentó el ROS celular y disminuyó la viabilidad celular 39 . La exposición a RF-EMF a 1.8 GHz a 2 SAR durante 24 h causó daño oxidativo del ADN en las mitocondrias y el ADN DSB en las neuronas primarias de ratas 15 . La exposición a RF-EMF a 1,8 GHz a 0,15 W / Kg durante 3 h también indujo una generación de mitocondrias ROS y fragmentación de ADN en líneas celulares de espermatogonias y espermatocitos inmortalizados de ratón 14. En conjunto, estos estudios, incluido el nuestro, que usan 1.7 ~ 1.8 GHz RF-EMF sugieren fuertemente que el aumento de ROS generado por RF-EMF induce cambios fisiológicos en varias células de mamíferos, aunque el resultado fisiológico variará dependiendo de la cantidad de ROS generada y la sensibilidad de diferentes tipos de células a la concentración específica de ROS. Con el fin de comprender el mecanismo de generación celular de ROS por RF-EMF, se necesitan más estudios para evaluar la expresión y la actividad de enzimas antioxidantes como la glutatión peroxidasa, la superóxido dismutasa y la catalasa en células expuestas a 1.7 GHz RF-EMF . La reacción de Fenton y Haber-Weiss juega un papel importante en el estrés oxidativo mediante la generación de • OH (radicales hidroxilo) a partir de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y superóxido (• O2  ) por iones de hierro intracelulares, que sirven como mecanismo para el envejecimiento celular, porque los radicales hidroxilo generados por la reacción causan daño al ADN, proteínas y lípidos en la célula 32 . Dependiendo de la concentración de radicales hidroxilo y la extensión de los daños genotóxicos, las respuestas fisiológicas de las células pueden variar, desde la detención y reparación del ciclo celular hasta la senescencia y la muerte celular. Para comprender la contribución de la reacción de Fenton y Haber-Weiss en el efecto observado de RF-EMF para inducir la senescencia en este estudio, los cambios relativos de las concentraciones intracelulares de radicales hidroxilo sobre peróxido de hidrógeno y superóxido por exposición a RF-EMF deben medirse con precisión , aunque sería un desafío técnico.

Shahbazi-Gahrouel y col . examinó el efecto de los teléfonos móviles GSM de 900 MHz con una intensidad de 354,6 μW / cm 2 en los ASC humanos, el mismo tipo de células que usamos en este estudio, e informó que las tasas de proliferación de los ASC humanos disminuyeron significativamente dependiendo del tiempo de duración de exposición 36 . Este informe mostró el efecto antiproliferativo constante de RF-EMF en ASC con el nuestro, a pesar de que dos estudios utilizaron RF-EMF de diferentes frecuencias. Por otro lado, Su et al . informaron que la exposición a RF-EMF de 1.8 GHz a las células SH-SY5Y a 4 SAR por hasta 48 h no provocó daño en el ADN ni comportamientos celulares anormales 9. Este resultado es consistente con el nuestro en que no se indujo daño en el ADN por 1.7 ~ 1.8 RF-EMF, pero es diferente del nuestro con respecto a su efecto sobre la proliferación celular. Dado que el tiempo de exposición en nuestro estudio fue de 72 h, mientras que fue de 42 h en el estudio de Su et al ., Predecimos que un lapso de exposición continua podría ser un factor clave para producir diferentes resultados fisiológicos de las células humanas por RF-EMF.

En conjunto, este estudio y otros estudios sugieren fuertemente que la exposición a RF-EMF conduce a un cambio en los niveles intracelulares de ROS que puede resultar en estrés genotóxico, disminución de la proliferación y senescencia celular, o ausencia de efectos fisiológicos dependiendo de la concentración de ROS y la sensibilidad diferencial de Varias células a ROS. Por lo tanto, el mecanismo detrás de la exposición a RF-EMF que altera los niveles intracelulares de ROS debe estudiarse más a fondo para dilucidar los efectos biológicos de los RF-EMF.

No es posible predecir directamente los efectos fisiológicos de 1.7 GHz LTE RF-EMF de nuestro estudio basado en células. Sin embargo, el efecto antiproliferativo de 1.7 GHz LTE RF-EMF en varias células humanas en este estudio sugiere que la exposición a 1.7 GHz LTE RF-EMF sería más dañina para los niños, cuyas células madre adultas deberían ser muy activas para el crecimiento y Puede acelerar el envejecimiento de las células del cuerpo. También sugerimos cuidadosamente que el efecto antiproliferativo de varias células cancerosas por 1.7 GHz LTE RF-EMF se interprete con cuidado, teniendo en cuenta que se han reportado efectos positivos y negativos de RF-EMF en el desarrollo del cáncer.

Materiales y métodos

Diseño del sistema de exposición celular de radiofrecuencia.

Se usó un sistema de exposición de línea de transmisión radial (RTL) 40 , 41 , 42 como sistema de exposición in vitro , ya que pueden exponer simultáneamente una gran cantidad de platos de cultivo. La señal LTE de 1.76 GHz se aplicó al sistema de exposición RTL (Fig.  1A ). El nivel de exposición y el cronograma fueron controlados por una unidad de control y la potencia de entrada máxima fue de 60 W. La señal de entrada se alimentó a través de una antena cónica con características de banda ancha. Las dimensiones externas del sistema de exposición fueron 843 mm × 825 mm × 315 mm (Fig.  1B ). El sistema de exposición fue diseñado específicamente para controlar las condiciones ambientales, incluida la ventilación, la humedad y la temperatura. Para mantener el CO 2Densidad y humedad dentro de la cámara, el gas de una incubadora circulaba por toda la cámara. Además, se usó una bomba de agua que circulaba agua por todo el fondo de la cavidad para controlar la temperatura. En este estudio, se utilizaron dos tipos de bombas de agua. Uno se usó para hacer circular el agua a la temperatura establecida sin activar el sistema de enfriamiento, y el otro se usó para proteger contra el aumento de la temperatura del medio de cultivo durante la exposición a RF al hacer circular el agua desde el sistema de enfriamiento. La pérdida de retorno del sistema de exposición fue inferior a -10 dB de 800 MHz a 5 GHz (Fig.  1C), que es la relación entre la potencia reflejada y la potencia incidente en decibelios (dB). Significa qué tan bien coincide el sistema sin reflexión. El sistema funciona bien si la pérdida de retorno es inferior a -10 dB a la frecuencia de operación. La medición de SAR se realizó utilizando un termómetro de fibra óptica Luxtron 812 de Luxtron Corporation con una resolución térmica de 0.1 ° C. Las sondas de medición se ubicaron en nueve puntos dentro de una placa de Petri (Fig.  1D ). La Figura  1E muestra los gráficos de la temperatura del cultivo celular en el centro de una placa de Petri para exposición a 1,7 GHz LTE. La pendiente del aumento de la temperatura se deriva mediante un ajuste lineal de las temperaturas medidas. Los valores de SAR se calcularon a partir del aumento de temperatura utilizando la ecuación que se muestra a continuación:

SAR=CpΔTΔtCpdTdtSAR=CpΔTΔt≈CpdTdt

donde C p , T y t son el calor específico (J / kg ° C), el aumento de temperatura por exposición (° C) y el tiempo de exposición (s), respectivamente. Se realizaron tres mediciones en nueve puntos, como se muestra en la Fig.  1D . El valor medio y la desviación estándar de las mediciones de SAR para toda la muestra fueron 0.155 ± 0.004 W / kg / W, que se normalizó a la potencia de entrada de 1 W en el punto de alimentación.

Para examinar los efectos biológicos del campo de RF a través de experimentos con células in vitro , el dispositivo se instaló en una incubadora que proporciona un entorno similar al del cuerpo (Fig.  2C ). Para mantener la temperatura constante de la incubadora, se instaló un sistema de enfriamiento de agua para suprimir el aumento de la temperatura por los campos electromagnéticos (Fig.  2B ). El dispositivo de exposición de campo electromagnético tiene una antena en su centro, que genera un campo electromagnético y las placas de cultivo se colocaron a una ligera distancia del centro del dispositivo. Tuvimos que establecer la intensidad de campo exacta para exponer las células a la tasa de absorción específica (SAR) (Fig.  2D, E) Para exponer las células con el SAR deseado, se preparó una tabla de conversión de SAR utilizando cálculos de ingeniería (Fig.  2F ). Como se muestra en la Fig.  2G , el valor SAR (figura superior), así como la temperatura de la incubadora (línea inferior amarilla) y la temperatura de un sistema de refrigeración por agua refrigerada (línea inferior roja) del RF-EMF El dispositivo de exposición se monitorizó continuamente durante los experimentos de exposición celular.

Fuentes de células y cultivo celular.

Los ASC humanos se compraron de Thermo Fisher Scientific. Las células HeLa e IMR90 se compraron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las poblaciones de células madre del carcinoma hepatocelular humano Huh7 y Hep3B fueron obsequios del Dr. YN Park (Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei, Seúl, Corea). El neuroblastoma humano SH-SY5Y fue amablemente proporcionado por la Dra. Inhee Mook-Jung (Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, Corea). Las características de ASC, Huh7 y Hep3B se confirmaron verificando los marcadores celulares específicos por RT-PCR (Figura complementaria  S1 ) y los cebadores utilizados para RT-PCR se muestran en la Tabla  1 .

Tabla 1 Secuencias de los cebadores utilizados para RT-PCR en este estudio.

Los ASC humanos se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco / F12 (DMEM / F12, Gibco / Invitrogen, Grand Island, NY, EE. UU.), Carcinoma hepatocelular humano Huh7 y Hep3B, neuroblastoma humano SH-SY5Y y HeLa se cultivaron en DMEM (Gibco / Invitrogen, Grand Island, NY, EE. UU.), Ambos medios se complementaron con suero fetal bovino al 10% (v / v) (FBS; Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) Y 10 ml / L de penicilina-estreptomicina (GIBCO, NY, EE. UU.) ) IMR90 se mantuvo en medios esenciales mínimos (MEM; Gibco / Invitrogen, Grand Island, NY, EE. UU.) Con suero fetal bovino al 10% (v / v) (FBS; GIBCO, NY, EE. UU.) Y 10 ml / L de penicilina-estreptomicina ( GIBCO, NY, EE. UU.). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO 2 .

Exposición celular con el sistema de radiación LTE RF-EMF

El sistema de exposición se calentó durante al menos 30 minutos, para equilibrarlo, antes de la exposición a RF-EMF. Un total de 30 × 10 4 células ASC y 20 × 10 4 Huh7, Hep3B, HeLa, SH-SY5Y e IMR 90 células se sembraron e incubaron en una placa de 100 mm durante 16 h antes de la exposición a RF-EMF. Los platos de cultivo de 100 mm se colocaron a 13,6 cm de la antena cónica, que se encontraba en el centro de la cámara de exposición. Las células en las placas de cultivo se expusieron continuamente a la radiación RF-EMF de una sola señal LTE (señal WCDMA a 1700 MHz) a 1 W / kg o 2 W / kg durante 72 h. Durante la exposición, la temperatura de la incubadora se mantuvo a 35,5 ± 0,5 ° C haciendo circular agua dentro de la cavidad y un 5% de CO 2La concentración también se mantuvo en la cámara. Para ambas células para la exposición a RF-EMF y el control simulado sin tratamiento, las mismas células se sembraron al mismo tiempo y se incubaron en un plato de 100 mm durante 16 h antes de la exposición a RF-EMF en la misma incubadora. El grupo simulado no tratado se incubó durante 72 h en el mismo tipo de incubadora en las mismas condiciones de incubación que la incubadora conectada al dispositivo RF-EMF. Después de 72 h, se contó el número de células en cada placa de RF-EMF-expuesto y el grupo simulado usando un Cellometer Auto T4 (Nexcelom).

Análisis de Western Blot

Las células expuestas a RF-EMF / LTE se cosecharon y se lisaron con un tampón de lisis como se describió anteriormente 43. Las histonas se extrajeron con HCl 0,2 M y se neutralizaron con NaOH 1 M. Los lisados ​​celulares o las histonas se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 8-10% (PAGE), se transfirieron a una membrana de PVDF (Merck Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), Y se detectaron usando los siguientes anticuerpos primarios: anti-poli ADP-ribosa polimerasa (PARP; Cell Signaling Technology, Inc., MA, EE. UU.), anti-fosfo-H2AX (γ-H2AX; Millipore, Alemania), anti-p21 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EE. UU.), anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EE. UU.), Anti-fosfo-p53 (Cell Signaling Technology, Inc., MA, EE. UU.), Anti-retinoblastoma (Rb; Cell Signaling Technology, Inc., MA, EE. UU.) Y anti-fosfo-Rb (Cell Signaling Technology, Inc., MA, EE. UU.), anti-actina (Cell Signaling Technology, Inc., MA, EE. UU.) y anti-histona3 (Cell Signaling Technology, Inc., MA, EE. UU.) .

Ensayo de actividad de β-galactosidasa asociada a senescencia

La tinción de β-galactosidasa (SA-β Gal) asociada a la senescencia se realizó en ASC y una población CSC de células Huh7 expuestas a RF-EMF / LTE durante 72 h. Después de la incubación durante 72 h en RF-EMF / LTE, las células se fijaron en formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con una solución X-gal (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) Para 30 h, como se describió anteriormente 34 . Para los controles positivos de senescencia, ASC fueron tratados con H 2 O 2 200 M durante 1 h y Huh7 se trató con H 2 O 2 300 M durante 2 h. Las células teñidas con SA-β Gal se observaron con un microscopio Nikon (ECLIPSE Ts2) bajo un objetivo 10x y se monitorizaron con HKBasic ( http://www.koptic.co.kr ).

Análisis de citometría de flujo.

Las células expuestas a RE-EMF / LTE se cosecharon usando tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco-BRL) y se lavaron con PBS tibio. Las células se fijaron en etanol al 70% durante 1 ha 4 ° C, se trataron con RNasa A (100 μg / ml) durante 30 minutos a 37 ° C y se tiñeron con yoduro de propidio (PI 50 μg / ml) durante 1 ha 4 ° C en la oscuridad. Después de la tinción, la citometría de flujo se realizó con FACSCalibur (BD Bioscience) y se analizó con Flowing ( http://flowingsoftware.btk.fi ).

Detección de ROS intracelulares

Después de sembrarlas e incubarlas durante 16 h, las células se cultivaron en medio nuevo que contenía N-acetil-L-cisteína (NAC) 100 μM (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) Con exposición continua a RF-EMF durante 72 h. Las células ASC y Huh7 se incubaron independientemente con hidroperóxido de terc-butilo (TBHP) para generar ROS intracelulares como controles positivos. Las ROS intracelulares se midieron utilizando un kit de detección de ROS (Invitrogen, CA, EE. UU.) Siguiendo el protocolo del fabricante, como se describió anteriormente 31 . Brevemente, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con 25 μM de diacetato de 5- (y -6) carboxi-2 ‘, 7’-diclorodihidrofluoresceína (carboxi-H 2 DCFDA) durante 30 minutos a 37 ° C. Se añadió Hoechst 33342 1 μM al carboxi-H2 .Solución de tinción DCFDA durante los últimos 5 minutos de incubación. Las células se fijaron y se observaron con microscopía de fluorescencia Axioplan2 (Zeiss) con un objetivo de 200x.

Para detectar las ROS mitocondriales, las células ASC y Huh7 se lavaron dos veces con PBS tibio y se incubaron con MitoSOX Red 5 μM (Thermo Fisher Scientific) en PBS durante 20 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Se añadió Hoechst 33342 1 μM a la solución MitoSOX Red durante los últimos 5 minutos de incubación. Después del tratamiento, las células se lavaron tres veces con PBS caliente, se fijaron y se observaron con microscopía de fluorescencia Axioplan2 (Zeiss) con un objetivo 200x.

Fuentes químicas regentes

Medio de Eagle modificado por Dulbecco / F-12 (DMEM / F12), DMEM, se compran medios esenciales mínimos de Gibco / Invitrogen (Grand Island, NY, EE. UU.). La X-gal y la N-acetil-L-cisteína (NAC) se compraron de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE. UU.). El kit de detección de ROS se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). El MitoSOX Red se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Hillsboro, OR, EE. UU.).

análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., CA, EE. UU.). Todos los datos se presentan con la media ± desviación estándar (DE) de más de tres experimentos independientes con significaciones estadísticas. P <0.05 (*), P <0.01 (**) y P <0.001 (***) se consideraron estadísticamente significativos, y P> 0.05 se consideró estadísticamente no significativo (ns).

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Descargar referencias

Agradecimientos

Los autores aprecian a Anna Song en el laboratorio por editar el inglés de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Desarrollo de Tecnología Bio y Médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) [No. NRF-2016M3A9C6918275], y por el consorcio Korea Mobile EMF. J. Choi fue parcialmente respaldado por Brain Korea (BK) 21 PLUS de 2018 ~ 2019.

Información del autor

Afiliaciones

Contribuciones

JC y KM hicieron todos los experimentos (Figuras 3–8) y tomaron las fotos del dispositivo (Figura 2a – d) SJ, NK, J.-KP diseñó y fabricó el dispositivo RF-EMF (Figura 1–2) SJ dibujó el imágenes en la Figura 1. KS diseñó y supervisó todos los experimentos y escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Autor correspondiente

Correspondencia a Kiwon Song .

Declaraciones de ética

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información Adicional

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Información suplementaria

Derechos y permisos

Acceso abierto Este artículo está licenciado bajo una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, intercambio, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre que otorgue el crédito apropiado al autor (es) original y la fuente, proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo se incluyen en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visitehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ .

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Cita este artículo

Choi, J., Min, K., Jeon, S. y col. La exposición continua a campos electromagnéticos LTE de 1,7 GHz aumenta las especies de oxígeno reactivo intracelular para disminuir la proliferación de células humanas e inducir la senescencia. Sci Rep. 10, 9238 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-65732-4

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Origen: La exposición continua a campos electromagnéticos LTE de 1,7 GHz aumenta las especies de oxígeno reactivo intracelular para disminuir la proliferación de células humanas e inducir la senescencia | Reportes cientificos

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