Avanzados estudios virologicos muestran que la infección SARS-COV-2 induce anticuerpos de por vida capaces de eliminar las células infectadas independientemente de la gravedad de la enfermedad – Cell Reports Medicine

Tu sistema inmune ha sido, sigue siendo y será siempre tu mejor defensa. No te intoxiques con productos génicos experimentales

Basándose en estudios epidemiológicos de campo y en la cohorte hospitalaria FrenchCOVID, coordinada por el INSERM (Instituto Nacional de Investigación Médica), los equipos del Instituto Pasteur, el CNRS y el Instituto de Investigación sobre Vacunas (VRI, Inserm/Universidad París Este Créteil) estudiaron los anticuerpos inducidos en individuos infectados por el SARS-CoV-2 de forma asintomática o sintomática.

Los investigadores demostraron que la infección induce anticuerpos polifuncionales, es decir, anticuerpos con actividad neutralizante pero también capaces de activar otros mecanismos de defensa como las células NK (Natural Killer) o las moléculas del complemento. Los niveles de anticuerpos son ligeramente inferiores en los individuos asintomáticos en comparación con los sintomáticos, pero los anticuerpos polifuncionales se encuentran en todos los individuos. Estos resultados muestran que la infección induce anticuerpos capaces de eliminar las células infectadas independientemente de la gravedad de la enfermedad.

El estudio se publicó en la revista Cell Reports Medicine el 20 de abril de 2021.

Fuente: Las infecciones asintomáticas y sintomáticas de SARS-CoV-2 provocan anticuerpos polifuncionales, Jérémy Dufloo, Ludivine Grzelak, Isabelle Staropoli, Yoann Madec, Laura Tondeur, François Anna, Stéphane Pelleau, Aurélie Wiedemann, Cyril Planchais, Julian Buchrieser, Rémy Robinot, Marie-Noelle Ungeheuer, Hugo Mouquet, Pierre Charneau, Michael White, Yves Lévy, Bruno Hoen, Arnaud Fontanet, Olivier Schwartz, Timothée Bruel. Cell Reports Medicine, 20 de abril de 2021.

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Las infecciones asintomáticas y sintomáticas por SARS-CoV-2 provocan anticuerpos polifuncionales

Acceso AbiertoPublicado: 20 de abril de 2021DOI: https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2021.100275

Reflejos

  • Los sueros de pacientes con COVID-19 activan el sistema del complemento y matan las células infectadas por ADCC
  • Los individuos asintomáticos y sintomáticos albergan anticuerpos polifuncionales
  • Los niveles y funciones de los anticuerpos son ligeramente más bajos en individuos asintomáticos.
  • Las funciones de los anticuerpos anti-Spike tienen una cinética similar de inducción y contracción.

Resumen

Muchas personas infectadas con SARS-CoV-2 permanecen asintomáticas. Se sabe poco sobre el alcance y la calidad de su respuesta humoral antiviral. Aquí, analizamos las funciones de los anticuerpos en 52 individuos infectados asintomáticos, 119 levemente sintomáticos y 21 pacientes hospitalizados con COVID-19. Medimos los niveles de inmunoglobulina G (IgG), IgA e IgM anti-pico con el ensayo S-Flow y mapeamos los epítopos dirigidos a IgG con un ensayo Luminex. También evaluamos la neutralización, la deposición del complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) utilizando sistemas de células informadoras o SARS-CoV-2 con capacidad de replicación. Mostramos que los sueros de COVID-19 median la deposición del complemento y matan las células infectadas por ADCC. Los sueros de individuos asintomáticos neutralizan el virus, activan la ADCC y desencadenan la deposición del complemento. Los niveles y funciones de los anticuerpos son más bajos en los individuos asintomáticos que en los casos sintomáticos. Las funciones de los anticuerpos están correlacionadas, independientemente de la gravedad de la enfermedad. Los muestreos longitudinales muestran que las funciones de los anticuerpos siguen una cinética similar de inducción y contracción. En general, la infección asintomática por SARS-CoV-2 provoca anticuerpos polifuncionales que neutralizan el virus y se dirigen a las células infectadas.

Gráficamente abstracto

Introducción

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) surgió en 2019 y se convirtió en pandemia en 2020.

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 El SARS-CoV-2 es responsable de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).

Al 27 de marzo de 2021, casi 125 millones de personas estaban infectadas y 2,7 ​​millones habían muerto de COVID-19. La rápida propagación del virus ha abrumado a las organizaciones de atención médica en muchas áreas. En ausencia de estrategias profilácticas o terapéuticas, los gobiernos utilizaron medidas no farmacéuticas para disminuir la transmisión viral.

A medida que se relajaron las políticas restrictivas, muchos países experimentaron nuevas olas epidémicas, lo que demostró la necesidad de inmunidad de la población, provocada por la infección o la vacunación, para limitar la circulación del SARS-CoV-2. Por lo tanto, la respuesta inmune inducida por SARS-CoV-2 está bajo intensa investigación, con el objetivo de informar el diseño de la vacuna, identificar correlatos de protección y determinar la duración de la inmunidad protectora.

El resultado de la infección por SARS-CoV-2 es muy variable, desde una enfermedad asintomática hasta un síndrome de dificultad respiratoria aguda que pone en peligro la vida.

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 Aproximadamente la mitad de las personas infectadas permanecen asintomáticas.

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 Los hombres, los ancianos y las personas que padecen diabetes, obesidad y enfermedades cardiovasculares tienen un mayor riesgo de ingreso en unidades de cuidados intensivos (UCI) y muerte.

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 El COVID-19 grave se debe a disfunciones inmunológicas, incluida la respuesta alterada al interferón tipo I,

 aumento de la inflamación,

 activación del complemento,

 y estrés endotelial.

Debido a esta sobreactivación del sistema inmunológico y la exposición antigénica prolongada, los supervivientes de COVID-19 grave muestran una fuerte memoria inmunitaria al virus, según lo determinado por los títulos de anticuerpos y la reestimulación de las células T CD4 + .

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 Las infecciones leves y asintomáticas inducen seroconversión y producción de anticuerpos neutralizantes,

,

 pero los títulos son más bajos en individuos asintomáticos (EA).

Se desconoce si tales respuestas son protectoras. Se necesita una comprensión más profunda de la respuesta inmune después de una infección asintomática por SARS-CoV-2.

La proteína de pico de SARS-CoV-2 es responsable de la entrada viral al interactuar con el receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2).

Es una proteína de fusión de clase I, que requiere escisión proteolítica para su activación. Las dos subunidades S1 y S2 se ensamblan en un trímero de heterodímeros para formar el pico maduro.

 La subunidad S1 tiene conformaciones “cerradas” y “abiertas”, esta última exponiendo el dominio de unión al receptor (RBD), el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes.

 La proteína de pico está expuesta en la superficie de partículas virales y células infectadas,

haciéndolos sensibles a los anticuerpos dirigidos. Las actividades antivirales de los anticuerpos no se limitan a la neutralización de partículas virales. Las células infectadas cubiertas por anticuerpos pueden eliminarse a través de varios mecanismos, incluida la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

 Esas actividades se basan en el dominio fragmentado cristalizable (Fc) de los anticuerpos y los receptores Fc afines (FcR).

 Las funciones efectoras de Fc son necesarias para una eficacia óptima de los anticuerpos tanto en entornos terapéuticos como profilácticos.

 La capacidad de los anticuerpos para provocar funciones efectoras de Fc está gobernada por la especificidad del anticuerpo, los isotipos y la glicosilación.

Por tanto, las actividades antivirales mediadas por Fc no se pueden predecir a partir de los datos de unión y neutralización y requieren una evaluación funcional. Las funciones efectoras de Fc en la infección por SARS-CoV-2 siguen siendo poco estudiadas. Los anticuerpos en el suero de pacientes críticos con COVID-19 forman complejos inmunes que pueden desencadenar la activación de las células asesinas naturales (NK) y la deposición del complemento.

 La inducción de anticuerpos anti-pico IgG afucosilados con capacidad de unión a Fc aumentada se correlaciona con la gravedad de COVID-19.

 Sin embargo, se desconoce si se inducen anticuerpos polifuncionales durante la enfermedad COVID-19 asintomática y si pueden eliminar las células infectadas.

Aquí, establecimos ensayos celulares para evaluar la ADCC y complementar las actividades de los sueros de pacientes con COVID-19 con diferentes grados de gravedad de la enfermedad. Combinamos estos ensayos con mediciones de títulos de anticuerpos y neutralización. En conjunto, nuestros resultados indican que la infección asintomática por SARS-CoV-2 induce una respuesta de anticuerpos polifuncional.

Resultados

 Sueros de pacientes con COVID-19 activan el complemento

Primero determinamos si los anticuerpos de los pacientes con COVID-19 activan el complemento después de unirse a las células infectadas con el SARS-CoV-2. Usamos la línea celular epitelial pulmonar A549 que expresa ACE2 (células A549-ACE2) como células diana.

Las células se infectaron con SARS-CoV-2 con una multiplicidad de infección (MOI) de 1. Después de 24 h, las células se incubaron con suero inactivado por calor (HI) de individuos prepandémicos o COVID-19 como fuente de anticuerpos (dilución 1: 100). Seleccionamos un panel de 11 sueros de individuos infectados con SARS-CoV-2 sintomáticos (n = 9) o asintomáticos (n = 2) identificados en dos estudios seroepidemiológicos previos

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Tabla S2 ). Los sueros muestreados antes de 2019 (muestras prepandémicas) se utilizaron como controles (n = 12). La fuente del complemento fue suero humano normal (NHS) (dilución 1: 2). Se utilizó suero humano inactivado por calor (HIHS) como control ( Figura 1 A). Después de 4 h de incubación, las células se tiñeron con anticuerpos anti-C3b / iC3b y anti-pico para examinar la deposición del complemento y la infección por SARS-CoV-2, respectivamente. La deposición de C3b / iC3b (en lo sucesivo, denominada deposición de C3) se midió en células spike + . Como se muestra en un experimento representativo ( Figura 1 B), no observamos la deposición de C3 en ausencia de anticuerpos o con un suero prepandémico. En contraste, con un suero de COVID-19, la deposición de C3 ocurrió en el 79% de las células infectadas ( Figura 1B). Para calcular un punto de corte de positividad, determinamos la señal media de los 12 sueros prepandémicos y agregamos 3 desviaciones estándar (SD) ( Figuras 1 C y S1 A). Todos los sueros de COVID-19 menos uno mostraron deposición de C3b por encima de ese límite (p <0,0001; prueba de Mann-Whitney) ( Figuras 1 C y S1 A). No se observó deposición de C3 con HIHS ( Figuras 1 B y S1 B). A pesar de la deposición de C3, no observamos la muerte (citotoxicidad dependiente del complemento [CDC]) de las células infectadas ( Figuras 1 D y S1 C). Luego, realizamos un análisis de dosis-respuesta de los tres individuos de COVID-19 con la actividad más alta ( Figura S1D). Ese análisis reveló una activación eficaz del complemento a una alta dilución de suero (dilución efectiva del 50% [DE 50 ] hasta 1.151) y una completa falta de actividad en las muestras prepandémicas (DE 50  <100). También usamos células U2OS-ACE2-GFPsplit (también denominadas células S-Fuse).

Esta línea de células informadoras permite la cuantificación y la obtención de imágenes en vivo de la replicación del SARS-CoV-2 midiendo la formación de sincitios de GFP + tras la infección. De manera similar, detectamos depósito de complemento, pero no CDC de células infectadas con S-Fuse (no mostrado).

Para evaluar la contribución de los anticuerpos anti-pico a la deposición del complemento, diseñamos células Raji que expresan la proteína del pico. Elegimos células Raji porque carecen de CD59, un potente inhibidor de CDC.

Las células Raji-spike se incubaron con suero HI de individuos COVID-19 prepandémicos o convalecientes (dilución 1:33) y NHS como fuente de complemento (dilución 1: 2). Después de 24 h, se evaluó la muerte celular utilizando un tinte de viabilidad ( Figura 1 E). Los sueros COVID-19 mostraron actividad CDC por encima del umbral determinado por los sueros prepandémicos (p <0,0001; prueba de Mann-Whitney) ( Figura 1 F). La actividad de CDC en células con espigas Raji se correlacionó positivamente con la deposición de C3 en células infectadas con A549-ACE2 (r = 0,91, p <0,0001; correlación de Spearman) ( Figura 1 G).

 Los sueros de pacientes con COVID-19 desencadenan ADCC

Luego evaluamos la actividad ADCC de sueros de pacientes con COVID-19. Para visualizar ADCC, utilizamos células S-Fuse infectadas con SARS-CoV-2 como objetivos.

Se infectaron células S-Fuse durante 18 h con SARS-CoV-2 a una MOI de 0,1 y se incubaron con células NK primarias heterólogas (proporción 1: 1) en presencia o ausencia de suero (dilución 1: 100). Después de 4 h de co-cultivo, el área de células infectadas (GFP + ) se cuantificó usando un microscopio automático ( Figura 2 A). Los sincitios de GFP + que se formaron después de la infección eran fácilmente visibles ( Figura 2 B). La adición de células NK (proporción 1: 1) disminuyó el área de GFP en un grado similar a las condiciones de “sin suero” y “suero prepandémico”, probablemente debido a la actividad citotóxica basal de las células NK contra las células infectadas, independientemente de los anticuerpos ( Figura 2B). La señal de GFP desapareció casi por completo en presencia de un suero COVID-19 convaleciente ( Figura 2 B), lo que demuestra una inducción de ADCC por células NK. Es de destacar que las células infectadas con A549-ACE2 no fueron sensibles a ADCC (no se muestra). Por lo tanto, usamos células S-Fuse para interrogar a nuestro panel de sueros COVID-19 (n = 11; nueve sintomáticos y dos AS) y muestras prepandémicas (n = 13) utilizando seis donantes de células NK ( Figura 2 C) . Calculamos el grado de eliminación de GFP desencadenado por cada suero en comparación con la condición con células NK y sin suero. Los seis donantes de NK fueron activos en esta prueba, con variaciones en su eficacia ( Figura S2A). El valor medio de las muestras preepidémicas se utilizó para determinar un umbral de positividad (media + 3 DE). Usando este método, 10 de los 11 sueros de COVID-19 probados mostraron actividad ADCC (p <0,0001; prueba de Mann-Whitney) ( Figura 2 C). La titulación de los tres individuos de COVID-19 con la actividad más alta mostró una actividad ADCC eficiente a una dilución de suero alta (DE 50 hasta 6,330) y una falta de actividad en las muestras prepandémicas (DE 50  <100) ( Figura S2 B). Es importante destacar que los sueros de las células de pacientes con COVID-19 (n = 10) o de células individuales prepandémicas (n = 15) no mostraron ninguna actividad letal en ausencia de células NK ( Figura S2C). Las variaciones en la proporción de células NK a células diana afectaron la muerte espontánea de las células NK. No detectamos una eliminación de las células infectadas en una proporción de 1: 3 (NK a diana) y sólo una ligera muerte espontánea en una proporción de 1: 1 ( Figura S2 D). La actividad de ADCC específica del suero fue máxima en una proporción de 1: 1 y comenzó a disminuir en una proporción de 1:10 de células NK a células diana ( Figura S2 E).

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Figura 2 Los sueros de COVID-19 desencadenan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos por las células NK
Luego, realizamos experimentos de video-microscopía para determinar si la disminución de GFP se debió a la muerte de las células infectadas. Se cultivaron células S-Fuse infectadas con SARS-CoV-2 con células NK y COVID-19 o sueros prepandémicos. Se añadió yoduro de propidio (PI) al medio de cultivo para controlar la muerte celular. Se rastreó las células GFP + infectadas y se determinó su viabilidad ( Figura 2 D). Después de 4 h de co-cultivo, el 100% de las células infectadas murieron cuando estaban presentes las células NK y el suero COVID-19 ( Figura 2 D). Las células NK solas o con un suero prepandémico redujeron la viabilidad del fusible S en menor grado (p <0,0001; prueba de Mantel-Cox de rango logarítmico) ( Figura 2D). El análisis de los videos reveló que las células NK establecieron contactos con las células infectadas antes de la muerte ( Figura 2 E; Video S1 ). Estos resultados muestran que los sueros de pacientes con COVID-19 matan las células infectadas con SARS-CoV-2 por ADCC.
También utilizamos células Raji-spike y células indicadoras Jurkat-CD16-NFAT-rLuc como un ensayo simple para evaluar la ADCC de los sueros COVID-19. Este sistema mide la capacidad de un suero para activar NFAT a través de CD16 (la vía que inicia la ADCC en las células NK) en presencia de células diana que expresan antígenos ( Figura 2 F). Los sueros convalecientes activaron CD16 por encima del umbral calculado con las muestras prepandémicas (p <0,0001; prueba de Mann-Whitney) ( Figura 2 G). El grado de activación de CD16 se correlacionó con la actividad de ADCC contra las células infectadas con S-Fuse, lo que sugiere que los anticuerpos anti-pico contribuyen a la muerte de las células infectadas (r = 0,77, p <0,0001; correlación de Spearman) ( Figura 2 H).
En general, estos datos muestran que los sueros de individuos infectados con SARS-CoV-2 albergan anticuerpos polifuncionales que desencadenan la deposición del complemento y la ADCC. Las células NK eliminan las células infectadas en presencia de anticuerpos específicos, mientras que la activación del complemento no es lítica, al menos en las líneas celulares probadas aquí.

 Respuestas de anticuerpos en individuos asintomáticos y leves con COVID-19

Luego aprovechamos dos estudios seroepidemiológicos realizados en una escuela secundaria y en escuelas primarias, respectivamente,

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para determinar si los sueros de COVID-19 AS y los individuos sintomáticos (S) difieren en su capacidad para desencadenar la ADCC y la deposición del complemento. En la primera cohorte, identificamos un grupo de 21 individuos seropositivos, que no reportaron ningún síntoma (EA) ( Tabla S2 ). Como control, seleccionamos al azar a individuos seropositivos que informaron al menos un síntoma (Ss; n = 76 entre 137). Estos individuos padecían una enfermedad leve porque ninguno requirió suplementación de oxígeno externo u hospitalización. El grupo sintomático informó sus primeros síntomas en promedio 45 días antes de la extracción de sangre. Los EA eran más jóvenes que los S (16 versus 30 años; Tabla S2 ).

Con los sueros de estos 97 individuos, primero medimos la presencia de anticuerpos que se unen al pico, a una dilución de 1: 300 ( Figura 3 A). Adaptamos nuestro ensayo S-Flow, que permite una evaluación sensible y cuantitativa de IgG anti-picos mediante citometría de flujo,

para medir IgA e IgM ( Figura 3 A). De acuerdo con nuestra identificación previa como seropositivos, los AS y los S albergaban anticuerpos IgG, según lo determinado por un porcentaje de células spike + por encima del límite del 20% ( Figura 3 A). La frecuencia de células IgA + e IgM + tendió a ser menor en los AS sin diferencias significativas ( Figura 3 A). No observamos diferencias al analizar la intensidad de unión para individuos positivos para IgG, IgA e IgM ( Figura S3 A). Luego, medimos los títulos de unión de IgG mediante diluciones en serie. Las curvas de titulación de los AS fueron más bajas que las de los S ( Figura 3 B). ED 50fueron significativamente menores en AS (p = 0,018; prueba de Mann-Whitney) ( Figura 3 B). Debido a que la proteína de pico contiene múltiples epítopos,

utilizamos un ensayo Luminex para mapear IgG anti-S1, anti-S2, anti-RBD y anti-spike ( Figura 3 C). También incluimos la proteína N ( Figura 3 C), así como antígenos de hCoV-229E y hCoV-NL63 y de adenovirus 40, influenza A, paperas y virus de rubéola, para evaluar la inmunidad preexistente a coronavirus humanos estacionales y otros. virus ( Figuras S3 B – S3D). La respuesta global a los antígenos S1, S2, RBD, pico y N tendía a ser menor en los AS que en los S, aunque no de forma significativa ( Figuras 3 C y S3 B). No observamos diferencias entre AS y S en la respuesta de IgG a hCoV-229E y NL63 ( Figura S3C). La respuesta a los antígenos de los otros virus fue similar entre los dos grupos, excepto para la influenza A, lo que probablemente refleja la diferencia de edad (p = 0,001; prueba de Mann-Whitney) ( Figuras S3 D y S3E). En conjunto, estos datos muestran que la intensidad de la respuesta de anticuerpos específica al SARS-CoV-2 es ligeramente más baja en personas asintomáticas que en individuos levemente sintomáticos.

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Figura 3 Respuesta de anticuerpos al SARS-CoV-2 en sueros de individuos COVID-19 asintomáticos y levemente sintomáticos
Para documentar aún más la función de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2, medimos la capacidad de los sueros para neutralizar pseudotipos de picos lentivirales en células 293T-ACE2 (pseudo-neutralización)

 y virus SARS-CoV-2 en células S-Fuse (neutralización).

También cuantificamos la deposición del complemento y las actividades de ADCC utilizando los dos ensayos basados ​​en picos de Raji. Los sueros se interrogaron con diluciones en serie para calcular los títulos exactos de esas cuatro funciones. La mayoría de los sueros de AS y S fueron activos en estos ensayos ( Figura 4 ). Los sueros de AS muestran títulos ligeramente por debajo de los de S ( Figura 4 A). Sin embargo, las diferencias en la dilución inhibidora semimáxima (ID 50 ) no fueron significativas ( Figura 4 B). También comparamos el nivel máximo de respuesta ( Figura 4 C). El nivel de activación del complemento mediada por anticuerpos fue significativamente mayor en Ss que en AS (p = 0,036; prueba de Mann-Whitney) ( Figura 4 C).

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Figura 4 Caracterización funcional de los sueros de individuos COVID-19
En conjunto, nuestros datos muestran que los sueros de individuos infectados con SARS-CoV-2 albergan anticuerpos polifuncionales. Los AS tienen una capacidad disminuida para activar el complemento y tienen títulos de IgG más bajos.

 Correlaciones entre actividades antivirales de anticuerpos

Entonces, buscamos realizar un análisis no supervisado de las características del anticuerpo medidas en Ss y ASs. Primero creamos matrices de correlación de características de anticuerpos en cada grupo ( Figura 5 A). La respuesta a los antígenos de otros virus y hCoV no se correlacionó con las propiedades de los anticuerpos relacionados con el SARS-CoV-2. Las características correspondientes a SARS-CoV-2 parecieron correlacionarse positivamente en ambos grupos. La IgG anti-influenza A medida por Luminex se correlacionó negativamente con algunas características del SARS-CoV-2 en los AS, pero los coeficientes de correlación permanecieron bajos. ADCC ED 50 y la actividad máxima se correlacionaron más fuertemente con otras características en AS en comparación con Ss. Las características asociadas a IgM (intensidad fluorescente media de IgM [MFI] y% de IgM) parecían estar más fuertemente correlacionadas con otras características en el grupo S (Figura 5 A). En conjunto, este análisis revela ligeras diferencias en las respuestas de ADCC e IgM entre los grupos AS y S, con un alto nivel general de coordinación en cada grupo. De manera consistente, el análisis de componentes principales (PCA) no logró separar a los individuos según sus síntomas, lo que mostró que ninguna combinación de características de anticuerpos permitía una segregación estricta de los dos grupos ( Figura 5 B). Esta observación fue confirmada por la agrupación jerárquica no supervisada ( Figura S4 ).

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Figura 5 Similitud de la respuesta de anticuerpos en individuos asintomáticos y sintomáticos
En general, este análisis no supervisado muestra que la respuesta de anticuerpos al SARS-CoV-2 está coordinada en los grupos AS y S, con diferencias en las respuestas de ADCC e IgM.

 Respuesta de anticuerpos al SARS-CoV-2 en otros grupos de individuos asintomáticos, sintomáticos y hospitalizados

Para caracterizar aún más la funcionalidad de los anticuerpos en pacientes con COVID-19, analizamos una segunda cohorte establecida en escuelas primarias de Crépy-en-Valois, Francia (n = 1340; Fontanet et al .;

Tabla S3 ). Elegimos analizar este segundo grupo de AS por separado para asegurarnos de que los S utilizados en las comparaciones estuvieran infectados durante la misma ola epidémica para compensar la falta de la fecha de infección de los AS. Esta cohorte incluyó una gran proporción de niños (de 6 a 11 años). Seleccionamos todos los AS (n = 31) y formamos un grupo de individuos levemente sintomáticos emparejados por sexo y edad (Ss; n = 43 entre los 107 de la cohorte) ( Figura S5 A). También incluimos individuos hospitalizados (Hs) por COVID-19 de la cohorte francesa de COVID (n = 21). Como era de esperar, en comparación con los AS y S, los pacientes hospitalizados eran mayores, más a menudo varones, y se tomaron muestras antes de la aparición de los síntomas ( Tabla S4 ; Figura S5 B).

Evaluamos el perfil de anticuerpos anti-pico por S-Flow en los 95 individuos que formaban estos tres grupos (AS, S y H) ( Figura 6 A). Las frecuencias de IgG, IgA e IgM fueron significativamente mayores en los pacientes hospitalizados que en los EA (p = 0,0101, p <0,0001 yp <0,0001, respectivamente; prueba de Kruskal-Wallis). En comparación con los S, los pacientes hospitalizados albergaban significativamente más IgA e IgM (p = 0,0002 yp <0,0001, respectivamente; prueba de Kruskal-Wallis) ( Figura 6 A). La medición del MFI de unión de individuos IgG + , IgA + e IgM + mostró una mayor respuesta de IgG en los pacientes hospitalizados en comparación con los AS y una mayor respuesta de IgA en comparación con los S ( Figura S6A). También realizamos un análisis restringido para comparar solo AS y Ss. La frecuencia de las células IgA + e IgM + y el MFI de las células IgG + fueron significativamente mayores en Ss (p = 0,0007, p = 0,014, p = 0,018, respectivamente; prueba de Mann-Whitney) ( Figura S6 B).

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Figura 6 Similitud de la respuesta de anticuerpos en otros grupos de individuos asintomáticos, sintomáticos y hospitalizados
Luego medimos la pseudo-neutralización, ADCC y la capacidad de deposición del complemento de los 95 sueros. Las funciones de los anticuerpos eran paralelas a las de la unión del anticuerpo, con las actividades más alta y más baja en los pacientes hospitalizados y los AS, respectivamente ( Figura 6 B). Los individuos levemente sintomáticos puntuaron entre Hs y ASs ( Figura 6 B). Los Ss se parecían a los AS para el nivel de ADCC, con una actividad más baja que los Hs (p <0,0001; prueba de Kruskal-Wallis), pero eran similares a los Hs para la deposición del complemento ( Figura 6 B). Curiosamente, la neutralización, CDC, ADCC y anti-S IgG fueron significativamente más altos en los H que sobrevivieron en comparación con los casos fatales de COVID-19 ( Figura S6 C).
Para caracterizar aún más la respuesta anti-pico en estos tres grupos, realizamos un análisis de PCA sin supervisión, que incluyó las nueve características del anticuerpo. Los AS y los S se agruparon como se observó anteriormente en los primeros grupos. En contraste, Hs parecía divergente, con la mayoría de los individuos agrupados en el primer componente (PC-1) ( Figura 6 C). Las contribuciones de las nueve funciones a PC-1 variaron del 8% al 14%, lo que indica que Hs tuvo una respuesta general más alta, en lugar de un aumento en un conjunto limitado de funciones ( Figura S6 D).
Luego mezclamos los diferentes grupos de individuos que habíamos analizado por separado para aumentar el poder de nuestras pruebas estadísticas. Por lo tanto, comparamos la respuesta de anticuerpos de todos los AS y S (n = 52 yn = 119, respectivamente) ( Figuras S7 A-S7C). Las frecuencias de IgG, IgA e IgM fueron significativamente más bajas en AS que en Ss. Además, el MFI de la unión de IgG, así como las actividades de neutralización y complemento, fue significativamente menor en AS que en Ss. La actividad de ADCC también fue menor pero no alcanzó significación. La correlación entre la edad y los niveles de anticuerpos reveló una asociación positiva para IgG, IgA e IgM en Ss ( Figura S7 D).
Los resultados de que los AS albergan una respuesta de anticuerpos anti-pico polifuncional que es más baja que la de los S se confirmaron así en un segundo grupo de personas infectadas. Nuestros resultados también muestran que nuestro grupo de H, que fueron muestreados antes, eran mayores y, con mayor frecuencia, hombres, mostraron los niveles más altos de anticuerpos y funciones.

 Cinética de las funciones de los anticuerpos después de la infección por SARS-CoV-2

Luego, nos propusimos determinar la dinámica de las funciones de los anticuerpos después de la infección por SARS-CoV-2. Identificamos siete pacientes hospitalizados y 22 casos de COVID-19 levemente sintomáticos con muestreo longitudinal en nuestras cohortes. Debido a que solo se invitó a individuos sintomáticos a un segundo muestreo en nuestros estudios seroepidemiológicos, no se dispuso de muestras longitudinales para EA. Los pacientes hospitalizados tuvieron la resolución temporal más alta y fueron muestreados temprano después del inicio de los síntomas, con hasta ocho muestras por individuo, desde los días 6 al 23 después del inicio de los síntomas ( Figura S5 B). Así, documentamos la inducción de la respuesta polifuncional en estos pacientes hospitalizados ( Figura 7A). Se muestrearon dos veces a individuos con síntomas leves, con un intervalo de 25 a 29 días. El primer muestreo se realizó habitualmente 21 días después del inicio de los síntomas. Los individuos levemente sintomáticos nos permitieron evaluar la contracción de las respuestas inmunes ( Figura 7 B). Medimos los niveles de IgG, IgA e IgM; ADCC; deposición de complemento; y neutralización o pseudo-neutralización en las muestras longitudinales disponibles.

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Figura 7 Cinética de las funciones de los anticuerpos en pacientes hospitalizados agudos e individuos convalecientes levemente sintomáticos
En los pacientes hospitalizados, todas las funciones, excepto la deposición del complemento, se indujeron simultáneamente entre 6 y 23 días después del inicio de los síntomas ( Figura 7 A). Este retraso puede reflejar una menor sensibilidad del ensayo, una aparición más lenta de anticuerpos potentes del complemento o un requisito de títulos altos de anticuerpos para desencadenar esta actividad.
En individuos levemente sintomáticos, observamos una disminución significativa en los títulos de unión de anticuerpos, su neutralización y su función ADCC a lo largo del tiempo (p = 0.011, p = 0.001, p = 0.001, respectivamente; prueba de Wilcoxon) ( Figura 7 B). También fue visible una disminución de la actividad de deposición del complemento con el tiempo, pero eso no fue significativo.

Discusión

En este estudio, mostramos que los AS montan una respuesta humoral anti-SARS-CoV-2 polifuncional. Nuestros resultados confirman y amplían los informes de disminución de los títulos de anticuerpos en los AS,

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en el que no se analizaron las funciones de anticuerpos asociadas a Fc. Los niveles de anticuerpos son menores en los AS y, por tanto, también se reducen su actividad neutralizante y sus funciones mediadas por Fc. Sin embargo, las diferencias son modestas y no siempre significativas. Nuestros resultados fueron consistentes en dos cohortes, a pesar de diferencias menores, como niveles más bajos de IgA e IgM en los AS en la segunda cohorte, en comparación con la primera. Estas diferencias pueden atribuirse a varios tiempos de muestreo después de la aparición de los síntomas y a las variaciones de edad. De hecho, las dos investigaciones serológicas no se realizaron al mismo tiempo, lo que explica la diferencia en el tiempo medio después de la aparición de los síntomas. Esta es la razón por la que optamos por mantener los análisis separados, para evitar comparar AS con S infectados en diferentes oleadas epidémicas. Sin emabargo,

También observamos que los Hs muestran altos niveles de anticuerpos específicos anti-SARS-CoV-2. Sin embargo, nuestro grupo de H se muestreó antes, era mayor y era más a menudo masculino que nuestros grupos de S y AS. Curiosamente, se ha informado de que la unión y neutralización de anticuerpos son mayores en casos graves y críticos.

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 Esto sugiere que la gravedad de la enfermedad impulsa el aumento de los niveles y la funcionalidad de los anticuerpos, según lo informado por otros.

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La investigación futura de las funciones de los anticuerpos en grupos emparejados por edad y género revelará la contribución de esos parámetros a la respuesta inmune al SARS-CoV-2. Además, mostramos que la deposición del complemento y las actividades de ADCC también están elevadas en pacientes hospitalizados. Se ha informado de un aumento en los niveles de C5a soluble proporcional a la gravedad de COVID-19 y niveles altos de expresión de C5aR1 en sangre y células mieloides pulmonares.

 Se desconoce el origen de la activación del eje C5a-C5aR1 en el COVID-19 grave.

 Si la activación del complemento mediada por anticuerpos en la superficie de las células infectadas participa en la gravedad de la enfermedad merece una mayor investigación.

Es de destacar que la actividad neutralizante de los anticuerpos se correlaciona con su capacidad para mediar la deposición del complemento y la ADCC, independientemente de la gravedad de la enfermedad. Un análisis longitudinal piloto realizado en algunos de los pacientes hospitalizados demostró además que la adquisición de las diferentes funciones aumentaba de manera similar las horas extraordinarias. Sin embargo, la capacidad de desencadenar la deposición del complemento se retrasó una semana en comparación con la ADCC y la neutralización. Esto puede deberse a una menor sensibilidad de nuestra prueba del complemento o al hecho de que la deposición del complemento requiere títulos de anticuerpos más altos que las otras funciones. Al analizar pacientes con síntomas leves en dos puntos de tiempo, muestreados hasta 70 días después del inicio de los síntomas, también observamos una disminución en los niveles y funciones de anticuerpos.

Esto sugiere que las actividades de neutralización y mediadas por Fc no son realizadas por los mismos anticuerpos, y / o que las vidas medias de los anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes son diferentes. De manera consistente, se ha demostrado que las IgG, IgA e IgM anti-picos siguen una cinética distinta de inducción y contracción.

 Un análisis de anticuerpos monoclonales derivados de pacientes convalecientes ayudará a determinar si las diferentes funciones pueden disociarse, lo que puede depender del isotipo o del epítopo reconocido por los anticuerpos individuales.

¿Cuáles son las consecuencias de la deposición del complemento en la membrana plasmática? Mostramos aquí que los sueros de pacientes con COVID-19 desencadenaron fácilmente la deposición de C3 en la superficie de las células S-Fuse o A549-ACE2 infectadas, pero la deposición de C3 no indujo la muerte celular detectable. Esto puede deberse a la presencia de moléculas, como CD59, CD55 y CD46, que contrarrestan la muerte dependiente del complemento. Células en punta Raji, que carecen de CD59,

de hecho, murieron fácilmente después de la deposición del complemento. Por el contrario, las células S-Fuse infectadas fueron rápidamente eliminadas por las células NK, cuando se añadieron anticuerpos anti-SARS-CoV-2 al medio de cultivo. Nuestros resultados sugieren que las células NK son más potentes que las células del complemento para matar células infectadas con SARS-CoV-2 después de la activación por anticuerpos. Esto está en línea con observaciones anteriores con otros virus. Por ejemplo, las células NK pueden eliminar las células infectadas con VIH-1, pero no las CDC.

 En los pacientes con COVID-19, los principales objetivos celulares del SARS-CoV-2 son las células ciliadas de las vías respiratorias y los neumocitos alveolares de tipo II.

 El receptor viral ACE2 se expresa en otros tejidos además del tracto respiratorio, y varios estudios han demostrado que el SARS-CoV-2 tiene un gran tropismo celular.

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 Los niveles de moléculas que regulan CDC y ADCC varían entre los tipos de células.

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Por tanto, es probable que estas células muestren diferentes susceptibilidades a ADCC y CDC. El trabajo futuro ayudará a comprender la sensibilidad de las células diana naturales a los anticuerpos antivirales, el destino y el papel de las células infectadas recubiertas con complemento y la contribución general de las funciones de anticuerpos no neutralizantes a la respuesta inmune al SARS-CoV-2.

Los niveles de anticuerpos dirigidos a otros virus, incluidos dos coronavirus estacionales, fueron similares en AS y S, lo que sugiere que estas infecciones previas no afectaron la gravedad de la enfermedad. Una excepción notable fue un título más alto de anticuerpos contra la gripe en personas sintomáticas. Las razones de esto quedan por caracterizar, pero una explicación simple puede estar relacionada con la edad más avanzada de los individuos sintomáticos en la primera cohorte.
Nuestros datos no proporcionaron un escenario que explique por qué algunas personas permanecen asintomáticas. Más bien, muestra que la respuesta de anticuerpos de los AS, a pesar de ser menor, no es dramáticamente diferente a la de los Ss. Se ha informado que la IgA neutralizante domina la respuesta temprana de anticuerpos neutralizantes al SARS-CoV-2.

 Las respuestas rápidas de IgA pueden ser más frecuentes en los AS que en los S, lo que destaca una diferencia entre estas dos categorías de individuos.

Por tanto, una inducción temprana de anticuerpos funcionales puede contribuir al fenotipo asintomático. Es probable que un control rápido del virus disminuya la carga antigénica general, lo que también explica la menor respuesta de anticuerpos observada en los EA en momentos posteriores. Desafiar esa hipótesis requeriría un muestreo longitudinal de AS. Eso no fue posible en nuestro estudio porque los EA se identificaron retrospectivamente a través de estudios seroepidemiológicos. Sin embargo, observamos una tendencia a una mayor correlación entre el MFI de IgA y otras características de anticuerpos en los AS, lo que sugiere que pueden albergar un perfil de IgA distintivo. Por lo tanto,

Las vacunas en desarrollo tienen como objetivo producir anticuerpos anti-picos neutralizantes.

La región Fc es necesaria para una eficacia óptima de los anticuerpos monoclonales anti-pico in vivo a través de mecanismos que pueden involucrar a los descritos aquí.

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 Los anticuerpos no neutralizantes participan en la protección que ofrecen las vacunas experimentales contra la influenza o el VIH.

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 Será de interés evaluar si los candidatos a la vacuna del SARS-CoV-2 provocan funciones de anticuerpos no neutralizantes y si esas funciones se correlacionan con la eficacia de la vacuna.

En conclusión, mostramos aquí que los AS montan una respuesta inmune humoral solo ligeramente disminuida en comparación con las infecciones sintomáticas por SARS-CoV-2. Esta respuesta incluye, además de la neutralización, la capacidad de desencadenar ADCC y la deposición del complemento. Nuestros resultados justifican un análisis más detallado de la neutralización y otras funciones de los anticuerpos en la evaluación de candidatos a vacunas y el estudio de la inmunopatología de COVID-19.

 Limitaciones del estudio

Nuestro estudio tiene limitaciones. El primero es la ausencia de información sobre la fecha de adquisición del virus en los AS. Sin embargo, se tomaron muestras tanto de S como de AS al comienzo de la epidemia en el norte de Francia y probablemente se infectaron en poco tiempo. Esta es también la razón por la que analizamos los dos grupos de AS por separado, para compararlos con los S infectados durante la misma ola epidémica. Otra limitación es la falta de confirmación por PCR para los EA y los individuos con síntomas leves. Nuestro análisis, por tanto, está restringido a las personas que se han seroconvertido. Además, los diferentes grupos no estaban todos emparejados por edad. En nuestro primer grupo, los AS eran, como se esperaba, más jóvenes que los S. Esto se equilibró en nuestro segundo grupo, en el que seleccionamos S para que coincidieran con la edad del grupo AS, pero H eran mayores que los AS y S en este estudio. Además, los H eran varones con mayor frecuencia. Estos sesgos limitan nuestra interpretación del vínculo entre ADCC y los niveles de complemento y la hospitalización. El trabajo futuro ayudará a arrojar luz sobre la influencia de la edad y otras características clínicas y biológicas en la intensidad y polifuncionalidad de la respuesta de anticuerpos.

Métodos STAR ★

 Tabla de recursos clave

REACTIVO o RECURSO FUENTE IDENTIFICADOR
Anticuerpos
Ab monoclonal anti-Spike biotinilado Amable obsequio del Dr. Hugo Mouquet (Institut Pasteur, París, Francia) N / A
Anti-IgM humano Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific Cat # A-21215; RRID: AB_2535800
Anti-IgA humana Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch Cat # 109-605-011; RRID: AB_2337883
Anti-IgG humano Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific Cat # A-21445; RRID: AB_2535862
Anticuerpo APC anti-C3b / iC3b Tebu-bio Cat # CL7631APC; RRID: AB_11188343
Cepas bacterianas y virales
Cepa BetaCoV del SARS-CoV-2 / Francia / IDF0372 / 2020 Centro Nacional de Referencia de Virus Respiratorios (Institut Pasteur, París, Francia) N / A
Productos químicos, péptidos y proteínas recombinantes
Hoechst 33342 Invitrogen Cat # H3570
Paraformaldehído 4% Alfa Aesar Cat # J19943.K2
Estreptavidina R-PE Invitrogen Cat # SA10044
Yoduro de propidio Invitrogen Cat # P3566
Ensayos comerciales críticos
Kit de aislamiento de células NK, humano Miltenyi Biotec No de gato 130-092-657
Bioensayo de reportero de ADCC Promega Cat # G7010
Kit de tinción de células muertas Aqua reparable LIVE / DEAD Invitrogen Cat # L34957
Sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo Promega Cat # E2620
Modelos experimentales: líneas celulares
Células Raji ATCC Cat # CCL-86
Células 293T ATCC Cat # CRL-3216
Celdas A549 ATCC Cat # CCL-185
Células U2OS ATCC Cat # HTB-96
Software y algoritmos
Software de análisis e imágenes de alto contenido Harmony PerkinElmer Cat # HH17000012
Excel 365 Microsoft https://www.microsoft.com/en-ca/microsoft-365/excel
Prisma 8 Graphpad https://www.graphpad.com/
R v4.0.2 (22 de junio de 2020) La Fundación R para la Computación Estadística www.r-project.org
Rstudio v1.3.959 RStudio https://www.rstudio.com
FlowJo v10 Estrella del árbol https://www.flowjo.com/

 Disponibilidad de recursos

 Contacto principal

Más información y solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse al contacto principal Timothée Bruel ( timothee.bruel@pasteur.fr ).

 Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

 Disponibilidad de códigos y datos

Este estudio no generó ni analizó conjuntos de datos ni código.

 Modelo experimental y detalles del tema.

 Muestras humanas

 Sueros de individuos prepandémicos

Se tomaron muestras de sueros prepandémicos de 200 donantes de sangre sanos anonimizados reclutados entre septiembre de 2014 y abril de 2019 en los sitios de Val d’Oise de EFS (la agencia francesa de sangre). La plataforma ICAReB (código BRIF n ° BB-0033-00062) del Institut Pasteur recopila y gestiona los recursos biológicos siguiendo los estándares de calidad ISO (Organización Internacional de Normalización) 9001 y NF S 96-900. Se puede encontrar más información sobre los participantes incluidos en la Tabla S1 .

 Sueros de individuos asintomáticos y sintomáticos

Tras la primera transmisión local documentada de SARS-CoV-2 en Francia, la investigación del brote y el rastreo de contactos identificaron dos casos en la escuela secundaria de Crépy-en-Valois (Francia) el 2 de febrero de 2020. Realizamos dos estudios seroepidemiológicos retrospectivos en la ciudad. :

  • (I)
    Primero, un estudio de cohorte cerrado retrospectivo en la escuela secundaria.

    Entre el 30 de marzo y el 4 de abril, se invitó a participar en la investigación a todos los alumnos, así como a profesores y personal no docente (administrativo, limpieza, restauración) del instituto (n = 1200). Los participantes completaron un cuestionario que cubría información sociodemográfica y se tomó una muestra de sangre de 5 mL (n = 661). Algunos de los participantes (n = 203) tuvieron una muestra de sangre previa como parte de una investigación inicial del grupo del 3 al 4 de marzo de 2020. Se puede encontrar más información sobre los participantes incluidos en la Tabla S2 .

  • (ii)
    En segundo lugar, una investigación en las escuelas primarias.

    Invitamos a todos los alumnos, profesores y personal no docente (administrativo, limpieza, catering) de cada una de las seis escuelas primarias que estaban matriculados en la escuela desde el inicio de la epidemia (estimado alrededor del 13 de enero de 2020) hasta el momento de la investigación del 28 al 30 de abril de 2020. Los participantes (con la ayuda de sus padres en el caso de los alumnos) completaron un cuestionario que cubría información sociodemográfica y se tomó una muestra de sangre de 5 mL (n = 1340). Se puede encontrar más información sobre los participantes incluidos en la Tabla S3 .

Estos estudios están registrados en Clinicaltrials.gov (ID: NCT04325646) y recibieron la aprobación ética del Comité de Protection des Personnes Ile-de-France (CPP-IDF) III. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en el estudio. La plataforma ICAReB (código BRIF n ° BB-0033-00062) del Institut Pasteur recopiló y gestionó los recursos biológicos siguiendo los estándares de calidad ISO (Organización Internacional de Normalización) 9001 y NF S 96-900.

 Sueros de pacientes hospitalizados con COVID-19

Las muestras de suero de casos de COVID-19 hospitalizados se obtuvieron del Hôpital Bichat-Claude-Bernard como parte de la cohorte francesa de COVID-19. Cada participante proporcionó su consentimiento por escrito para participar en el estudio, que fue aprobado por la junta de revisión de investigación regional (CPP-IDF VII, París, Francia) (ID RCB: 2020-A00256-33) y realizado de acuerdo con las directrices europeas y la Declaración de Helsinki. Se puede encontrar más información sobre los participantes incluidos en la Tabla S4 .

 Células NK primarias

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre periférica de donantes humanos sanos del Etablissement Français du Sang (EFS), de acuerdo con las directrices éticas locales. Las células NK se enriquecieron mediante selección magnética negativa (Miltenyi) y se cultivaron durante la noche (37ºC) en medio RPMI completo antes de su uso. Se puede encontrar más información sobre los participantes incluidos en la Tabla S1 .

 Líneas celulares

Se cultivaron células Raji (ATCC® CCL-86) en medio RPMI completo (suero de ternero fetal al 10% (FCS), penicilina / estreptomicina (PS) al 1%). Se cultivaron células 293T (ATCC® CRL-3216) y células U2OS (ATCC® HTB-96) en medio DMEM completo (FCS al 10%, PS al 1%). Se cultivaron células A549 (ATCC® CCL-185) en medio de mezcla de nutrientes F-12K con FCS al 10% y PS al 1%. Las células 293T, U2OS y A549 que expresan ACE2 de forma estable, y las células U2OS-ACE2 que expresan de forma estable el sistema GFPsplit (GFP1-10 y GFP11; células S-Fuse) se describieron previamente.

Se utilizaron blasticidina (10 μg / mL) y puromicina (1 μg / mL) para seleccionar la expresión de transgenes ACE2 y GFPsplit, respectivamente. Se generaron células 293T y Raji que expresaban de forma estable la proteína espiga de SARS-CoV-2 (GenBank: QHD43416.1) mediante transducción lentiviral y selección con puromicina (1 µg / ml). Se confirmó la ausencia de contaminación por micoplasmas en todas las líneas celulares con el kit de detección de micoplasmas Mycoalert (Lonza). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO 2 .

 Virus

La cepa BetaCoV / France / IDF0372 / 2020 del SARS-CoV-2 fue suministrada por el Centro Nacional de Referencia para Virus Respiratorios del Institut Pasteur (París, Francia). La muestra humana de la que se aisló la cepa ha sido proporcionada por el Dr. X. Lescure y Pr. Y. Yazdanpanah del Hospital Bichât, París, Francia. La cepa viral se suministró a través de la plataforma European Virus Archive Go Global (Evag) (beca de investigación e innovación Horizonte 2020 n ° 653316). La titulación de las reservas virales se realizó en Vero E6, con una técnica de dilución limitante que permitió un cálculo de PFU (unidad formadora de placa) / ml.

 Detalles de los métodos

 Análisis serológico de anticuerpos

 S-Flow

El ensayo S-Flow se realizó como se describió anteriormente.

Brevemente, se incubaron 293T-S a 4 ° C durante 30 min con sueros (dilución 1: 300, a menos que se especifique lo contrario) en PBS que contenía BSA al 0,5% y EDTA 2 mM, se lavaron con PBS y se tiñeron con Alexa Fluor anti-IgG 647 (dilución 1: 600; Thermo Fisher Scientific), o Alexa Fluor 488 anti-IgM (dilución 1: 600; Thermo Fisher Scientific) o Alexa Fluor 647 anti-IgA (dilución 1: 800; Jackson ImmunoResearch). Las células se lavaron con PBS y se fijaron durante 10 min utilizando paraformaldehído (PFA) al 4%. Los datos se adquirieron en un instrumento Attune NxT (Life Technologies). La unión específica se calculó con la siguiente fórmula: 100 x (% de unión en 293T-Spike -% de unión en células de control) / (100 -% de unión en células de control).

 Luminex

Se desarrolló un ensayo multiplex Luminex® MAGPIX® para medir las respuestas de anticuerpos IgG a los antígenos del SARS-CoV-2 (pico trimérico, S1, S2 RBD, nucleoproteína), nucleoproteína de dos coronavirus estacionales (NL63 y 229E) y antígenos de otros virus ( Influenza A H1N1, adenovirus tipo 40, paperas, rubéola).

 Ensayos de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos

 Ensayo ADCC en células infectadas

Se sembraron 4 x 10 3 células U2OS-ACE2-GFP-1-10 y 4 x 10 3 células U2OS-ACE2-GFP-11 en una placa μClear de 96 pocillos (Greiner Bio-One). Al día siguiente, las células se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 durante 18 h. Se agregaron células NK aisladas de PBMC de un donante sano (proporción 1: 1 a menos que se indique lo contrario) y sueros de individuos prepandémicos o COVID-19 (dilución 1: 100 a menos que se indique lo contrario). Después de 4 horas, las células se fijaron con PFA al 2%, se lavaron, se tiñeron con Hoechst (dilución 1: 1.000, Invitrogen) y se adquirieron con un microscopio confocal de alto contenido Opera Phenix (PerkinElmer). El área de GFP se cuantificó con el software Harmony (PerkinElmer). La ADCC se midió utilizando la siguiente fórmula: 100 x (área de GFP en “sin suero” – área de GFP en “suero probado”) / (área de GFP en “sin suero”).

 Ensayo indicador de activación de CD16

La ADCC se cuantificó utilizando el bioensayo informador ADCC (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 5×10 4 células Raji-spike se co-cultivaron con 5×10 4 células Jurkat-CD16-NFAT-Rluc en presencia o ausencia de pre-pandemia o COVID-19 sueros a la dilución indicada. La luciferasa se midió después de 18 horas de incubación usando un lector de placas EnSpire (PerkinElmer). La ADCC se midió como el pliegue de inducción de la actividad luciferasa en comparación con la condición “sin suero”.

 Ensayos de activación del complemento

 Ensayo de activación del complemento en células infectadas

1.5×10 4Las células A549-ACE2 se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se infectaron a una MOI de 1 durante 24 horas. Luego, se agregó suero prepandémico o COVID-19 como fuente de anticuerpos (dilución 1: 100) y suero normal (NHS) o inactivado por calor (HIHS) como fuente de complemento (dilución 1: 2). Después de 4 horas, las células se separaron usando PBS-EDTA y se incubaron 30 min a 4ºC con un anticuerpo anti-C3b / iC3b conjugado con APC (clon 6C9, Tebu-bio, dilución 1:50). Las células se lavaron con PBS y se fijaron con PFA al 4%. Para la tinción de Spike, las células se incubaron 30 min con un anticuerpo monoclonal anti-Spike biotinilado (10 μg / mL en PBS / BSA 0.5% / Saponin 0.05%), se lavaron e incubaron 30 min con Streptavidin R-PE (dilución 1: 100 en PBS / BSA al 0,5% / Saponina al 0,05%, Invitrogen). El anticuerpo anti-Spike fue un amable regalo de Hugo Mouquet (Institut Pasteur, París). Los datos se adquirieron en un instrumento Attune NxT (Life Technologies). Para cada suero, se calculó la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de las células infectadas usando la siguiente fórmula: 100 x (% de células infectadas con HIHS -% de células infectadas con NHS) / (% de células infectadas con HIHS).

 Ensayo de activación del complemento en células Raji-Spike

Se midió la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de las células Raji como se describió previamente.

Brevemente, se cultivaron células Raji-Spike (5×10 4 ) en presencia de suero humano 50% normal (NHS) o inactivado por calor (HIHS) y con o sin sueros prepandémicos o COVID-19 (diluidos 1:33 a menos que se indique lo contrario ). Después de 24 h, las células se lavaron con PBS y se añadió el marcador de células muertas acuáticas fijas vivas / muertas (1: 1.000 en PBS; Life Technologies) durante 30 min a 4ºC antes de la fijación. Los datos se adquirieron en un instrumento Attune NxT (Life Technologies). El CDC se calculó usando la siguiente fórmula: 100 x (% de células muertas con suero -% de células muertas sin suero) / (100 -% de células muertas sin suero).

 Ensayos de neutralización

 Ensayo de pseudo-neutralización

2×10 4 células 293T-ACE2 se sembraron en placas de 96 pocillos. Los pseudotipos lentivirales Spike de ciclo único que codifican un gen indicador de luciferasa se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con el suero a analizar en la dilución indicada y se añadió a las células. La señal de luciferasa se midió después de 48 h. El porcentaje de neutralización se calculó con la siguiente fórmula, estableciendo la condición “sin suero” en 0% y la condición “sin pseudotipo” en 100%: 100 x (1 – (valor con suero – valor con “sin pseudotipo” ) / (valor con “sin suero” – valor con “sin pseudotipo”)).

 Ensayo de neutralización del SARS-CoV-2

4×10 3 U2OS-ACE2-GFP-1-10 y 4×10 3Las células U2OS-ACE2-GFP-11 se sembraron durante la noche en una placa de 96 pocillos μClear (Greiner Bio-One). Se incubó SARS-CoV-2 con sueros a las diluciones indicadas durante 30 minutos a temperatura ambiente y se añadió a las células (MOI 0,1). 18 horas después, las células se fijaron con PFA al 2%, se lavaron, se tiñeron con Hoechst (dilución 1: 1.000, Invitrogen) y se adquirieron con un microscopio confocal de alto contenido Opera Phenix (PerkinElmer). Para cada pocillo, el área de GFP y el número de núcleos se cuantificaron utilizando el software Harmony (PerkinElmer). El porcentaje de neutralización se calculó usando el recuento de núcleos o el área de GFP usando la siguiente fórmula, estableciendo la condición de “sin suero” en 0% y la condición de no infectado en 100%: 100 x (1 – (valor con suero – valor en “no infectado”) / (valor en “sin suero” – valor en “no infectado”)).

 Imágenes en vivo

1×10 4 U2OS-ACE2-GFP-1-10 y 1×10 4 U2OS-ACE2-GFP-11 Las células se sembraron durante la noche en cada compartimento de un mm Quad μ-Dish35 (ibidi). Al día siguiente, las células se infectaron con una MOI de 0,1. 18 horas después, se añadieron células NK en una proporción de 1: 1 así como suero de un individuo prepandémico o de COVID-19 (dilución 1: 100). Las condiciones sin NK y suero (“Sin suero, sin NK”) y con células NK pero sin suero (“sin suero”) se incluyeron como controles. Se añadió yoduro de propidio (PI) (10 µg / ml, Invitrogen) para controlar la muerte celular. Las imágenes de transmisión y fluorescencia se adquirieron con un aumento de 20X cada 4 minutos durante 4 horas en una BioStation IM-Q (Nikon). Se registraron al menos 5 campos en cada condición. Las imágenes se analizaron utilizando el software FIJI.

 Cuantificación y análisis estadístico

Los cálculos, cifras y estadísticas se realizaron utilizando Excel 365 (Microsoft), Prism 9 (GraphPad Software) o RStudio Desktop 1.3.1093 (R Studio, PBC). Para el análisis de R usamos los siguientes paquetes: corrplot ( https://github.com/taiyun/corrplot ), pheatmap ( https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html ), factoextra y FactoMineR ( https://cran.r-project.org/web/packages/factoextra/index.html ) y readxl ( https://cran.r-project.org/web/packages/readxl/index.html ) . Toda la información sobre los tamaños de muestra y las pruebas estadísticas realizadas se puede encontrar en las leyendas de las figuras.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a las personas que donaron su sangre. Agradecemos a MM Rajah por la lectura crítica del manuscrito; J. Toubiana y S. Brisse (Institut Pasteur) por proporcionar muestras de suero prepandémicas; R. Lemahieu por organizar la encuesta epidemiológica; y el equipo ICAReB para el manejo y distribución de muestras de suero. Agradecemos a F. Mentre, S. Tubiana, la cohorte francesa COVID-19 y REACTing por el manejo de la cohorte. Agradecemos a S. Ferandes Pellerin y N. Jolly por su coordinación de los estudios CORSER. Este trabajo fue apoyado por la Campaña de Recaudación de Fondos Urgencia COVID-19 del Institut Pasteur. OS está financiado por Institut Pasteur, ANRS, Sidaction, el Instituto de Investigación de Vacunas (ANR-10-LABX-77), Labex IBEID (ANR-10-LABX-62-IBEID), el proyecto “TIMTAMDEN” (una colaboración de Inserm, Institut Pasteur e IRD; ANR-14-CE14-0029), el proyecto ANR “CHIKV-Viro-Immuno” (ANR-14-CE14-0015-01) y el programa de curación del VIH de Gilead. JD y LG cuentan con el apoyo del Ministerio de Educación Superior, Investigación e Innovación de Francia. HM está financiado por el Institut Pasteur, el Programa Milieu Intérieur (ANR-10-LABX-69-01), Inserm y las subvenciones REACTing y EU RECOVER. CP cuenta con el apoyo de una beca de la Agence Nationale de Recherches sur le Sida et les Hépatites Virales (ANRS).

Contribuciones de autor

Conceptualización y metodología, JD, LG, OS y TB; manejo de cohortes y recolección de muestras, AW, M.-NU, YL y BH; adquisición o análisis de datos, JD, LG, IS, YM, LT, FA, SP, CP, JB, RR, HM, PC, MW, AF, OS y TB; ensamblaje de datos y redacción de manuscritos, JD, LG, OS y TB; adquisición de fondos, HM, PC, MW, YL, BH, AF, OS y TB; supervisión, SG y TB

Declaración de intereses

PC es el fundador y director científico de TheraVectys. LG, IS, TB, RR, JB y OS son coinventores de la patente provisional núm. US 63 / 020,063 titulado “S-Flow: un ensayo basado en FACS para el análisis serológico de la infección por SARS-CoV2” presentado por Institut Pasteur.

Información suplementaria

Referencias

    • Wu F.
    • Zhao S.
    • Yu B.
    • Chen Y.-M.
    • Wang W.
    • Canción Z.-G.
    • Hu Y.
    • Tao ZW
    • Tian JH
    • Pei YY
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    • Grupo de estudio de cohorte francés COVID
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    • Cohorte de contacto de CoV
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    • Ámsterdam UMC Covid-19 Biobanco
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DOI: https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2021.100275

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