Haber tenido COVID – leve o asintomático – genera inmunidad de por vida – Revista Nature

La infección por SARS-CoV-2 induce células plasmáticas de médula ósea de larga duración en humanos

Abstracto

Las células plasmáticas de médula ósea de larga vida (BMPC) son una fuente persistente y esencial de anticuerpos protectores 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Las personas que se han recuperado de COVID-19 tienen un riesgo sustancialmente menor de reinfección con SARS-CoV-2 8 , 9 , 10 . No obstante, se ha informado de que los niveles de anticuerpos séricos anti-SARS-CoV-2 disminuyen rápidamente en los primeros meses después de la infección, lo que genera preocupación por la posibilidad de que no se generen BMPC de larga duración y la inmunidad humoral contra el SARS-CoV-2. de corta duración 11 , 12 , 13. Aquí mostramos que en individuos convalecientes que habían experimentado infecciones leves por SARS-CoV-2 ( n = 77), los niveles de anticuerpos séricos anti-SARS-CoV-2 spike protein (S) disminuyeron rápidamente en los primeros 4 meses después de la infección y luego más gradualmente durante los 7 meses siguientes, permaneciendo detectables al menos 11 meses después de la infección. Los títulos de anticuerpos anti-S se correlacionaron con la frecuencia de células plasmáticas específicas de S en los aspirados de médula ósea de 18 personas que se habían recuperado de COVID-19 entre 7 y 8 meses después de la infección. No se detectaron BMPC específicas de S en aspirados de 11 individuos sanos sin antecedentes de infección por SARS-CoV-2. Mostramos que las BMPC que se unen a S están inactivas, lo que sugiere que son parte de un compartimento estable. De manera consistente, se detectaron células B circulantes de memoria en reposo dirigidas contra el SARS-CoV-2 S en los individuos convalecientes. En general,

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Principal

Las reinfecciones por coronavirus estacionales ocurren de 6 a 12 meses después de la infección anterior, lo que indica que la inmunidad protectora contra estos virus puede ser de corta duración 14 , 15 . Los primeros informes que documentaron una rápida disminución de los títulos de anticuerpos en los primeros meses después de la infección en personas que se habían recuperado de COVID-19 sugirieron que la inmunidad protectora contra el SARS-CoV-2 podría ser igualmente transitoria 11 , 12 , 13 . También se sugirió que la infección con SARS-CoV-2 podría no provocar una respuesta funcional del centro germinal, lo que interferiría con la generación de células plasmáticas de larga vida 3 , 4 , 5 , 7 ,16 . Informes más recientes que analizan muestras que se recolectaron aproximadamente de 4 a 6 meses después de la infección indican que los títulos de anticuerpos del SARS-CoV-2 disminuyen más lentamente que en los primeros meses después de la infección 8 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 . Los títulos de anticuerpos séricos duraderos se mantienen mediante células plasmáticas de larga duración, es decir, células plasmáticas específicas de antígeno que no se replican y que se detectan en la médula ósea mucho después de la eliminación del antígeno 1 , 2 , 34 , 5 , 6 , 7.. Buscamos determinar si eran detectables en individuos convalecientes aproximadamente 7 meses después de la infección por SARS-CoV-2.

Decaimiento bifásico de los títulos de anticuerpos anti-S

Se recolectaron muestras de sangre aproximadamente 1 mes después del inicio de los síntomas de 77 individuos que estaban convalecientes de COVID-19 (49% mujeres, 51% hombres, edad promedio 49 años), la mayoría de los cuales habían experimentado una enfermedad leve (7.8% hospitalizados, Tablas de datos ampliadas 12). Se recolectaron muestras de sangre de seguimiento tres veces a intervalos de aproximadamente tres meses. Doce participantes convalecientes recibieron la vacuna BNT162b2 (Pfizer) o ARNm-1273 (Moderna) SARS-CoV-2 entre los dos últimos momentos; estas muestras posteriores a la vacunación no se incluyeron en nuestros análisis. Además, se recogieron aspirados de médula ósea de 18 de los individuos convalecientes entre 7 y 8 meses después de la infección y de 11 voluntarios sanos sin antecedentes de infección o vacunación con SARS-CoV-2. Se recolectaron aspirados de médula ósea de seguimiento de 5 de los 18 individuos convalecientes y de 1 donante convaleciente adicional aproximadamente 11 meses después de la infección ( Fig.1a , Tablas de datos ampliadas 3 , 4). Primero realizamos un análisis longitudinal de los anticuerpos séricos anti-SARS-CoV-2 circulantes. Mientras que los anticuerpos IgG de proteína (S) de pico anti-SARS-CoV-2 eran indetectables en la sangre de los individuos de control, 74 de los 77 individuos convalecientes tenían títulos séricos detectables aproximadamente 1 mes después del inicio de los síntomas. Entre 1 y 4 meses después del inicio de los síntomas, los títulos generales de anti-S IgG disminuyeron desde una dilución semimáxima media transformada en log ede 6,3 a 5,7 (diferencia media 0,59 ± 0,06, P <0,001). Sin embargo, en el intervalo entre 4 y 11 meses después del inicio de los síntomas, la tasa de disminución disminuyó y los títulos medios disminuyeron de 5,7 a 5,3 (diferencia media 0,44 ± 0,10, P  <0,001; Fig. 1a). En contraste con los títulos de anticuerpos anti-S, los títulos de IgG contra la vacuna inactivada contra el virus de la influenza estacional 2019-2020 se detectaron en todos los individuos de control y en los individuos que estaban convalecientes de COVID-19, y disminuyeron mucho más gradualmente, si es que lo hicieron durante el transcurso. del estudio, con títulos medios que disminuyeron de 8,0 a 7,9 (diferencia media 0,16 ± 0,06, P  = 0,042) y 7,9 a 7,8 (diferencia media 0,02 ± 0,08, P  = 0,997) a lo largo de 1 a 4 meses y 4 a intervalos de 11 meses después del inicio de los síntomas, respectivamente (Fig. 1b ).

Figura 1
Fig. 1: La infección por SARS-CoV-2 provoca títulos de anticuerpos anti-S en suero duraderos.

Inducción de BMPC de larga duración que se unen a S

La disminución temprana relativamente rápida de los niveles de anti-S IgG, seguida de una disminución más lenta, es consistente con una transición de anticuerpos séricos secretados por plasmablastos de vida corta a secreción por una población más pequeña pero más persistente de células plasmáticas de vida prolongada. generado más tarde en la respuesta inmune. La mayoría de esta última población reside en la médula ósea 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6. Para investigar si las personas que se habían recuperado de COVID-19 desarrollaron un compartimento de BMPC de larga duración específico del virus, examinamos los aspirados de médula ósea obtenidos aproximadamente 7 y 11 meses después de la infección para detectar BMPC anti-SARS-CoV-2 S específicas. Enriquecimos magnéticamente las BMPC de los aspirados y luego cuantificamos las frecuencias de las que secretan IgG e IgA dirigidas contra la vacuna contra el virus de la influenza 2019-2020, la vacuna contra el tétanos y la difteria y el SARS-CoV-2 S mediante el ensayo inmunoabsorbente de manchas enzimáticas (ELISpot) (Figura 2a). Las frecuencias de BMPC específicas de las vacunas contra la influenza y el tétanos y la difteria fueron comparables entre los individuos de control y los individuos convalecientes. Se detectaron BMPC específicas de S secretoras de IgG e IgA en 15 y 9 de los 19 individuos convalecientes, respectivamente, pero no en ninguno de los 11 individuos de control ( Fig.2b). En particular, ninguno de los individuos de control o individuos convalecientes tenía células secretoras de anticuerpos específicos S detectables en la sangre en el momento del muestreo de médula ósea, lo que indica que las BMPC detectadas representan células residentes en la médula ósea y no contaminación de plasmablastos circulantes. Las frecuencias de BMPC anti-S IgG se mantuvieron estables entre los 5 individuos convalecientes que fueron muestreados por segunda vez aproximadamente 4 meses después, y las frecuencias de BMPC anti-S IgA fueron estables en 4 de estos 5 individuos pero habían disminuido por debajo del límite de detección. en un individuo ( Fig.2c). De acuerdo con sus frecuencias estables de BMPC, los títulos de IgG anti-S en los 5 individuos convalecientes permanecieron consistentes entre 7 y 11 meses después del inicio de los síntomas. Los títulos de IgG medidos contra el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína S, un objetivo principal de los anticuerpos neutralizantes, se detectaron en 4 de los 5 individuos convalecientes y también se mantuvieron estables entre 7 y 11 meses después del inicio de los síntomas (Fig. 2d ). . Las frecuencias de las BMPC anti-S IgG mostraron una correlación modesta pero significativa con los títulos de anti-S IgG circulantes a los 7-8 meses después del inicio de los síntomas en individuos convalecientes, consistente con el mantenimiento a largo plazo de los niveles de anticuerpos por estas células ( r  = 0,48, P = 0,046). De acuerdo con informes anteriores 22 ,23 , 24 , las frecuencias de las BMPC de IgG específicas de la vacuna contra la influenza y los títulos de anticuerpos mostraron una correlación fuerte y significativa ( r  = 0,67, P  <0,001; Fig. 2e). Nueve de los aspirados de los individuos de control y 12 de los 18 aspirados que se recogieron 7 meses después del inicio de los síntomas de los individuos convalecientes produjeron un número suficiente de BMPC para un análisis adicional mediante citometría de flujo. Teñimos estas muestras intracelularmente con sondas de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza y S marcadas con fluorescencia para identificar y caracterizar las BMPC específicas de antígeno. Como controles, también teñimos intracelularmente células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios sanos una semana después de la vacunación contra el SARS-CoV-2 o el virus de la influenza estacional (Fig. 3a , Datos extendidos Fig. 1a-c). De acuerdo con los datos de ELISpot, se detectaron bajas frecuencias de BMPC de unión a S en 10 de las 12 muestras de individuos convalecientes, pero no en ninguna de las 9 muestras de control (Fig. 3b ). Aunque tanto los plasmablastos circulantes generados recientemente como las BMPC que se unen a S y HA expresaron BLIMP-1, las BMPC se diferenciaron por su falta de expresión de Ki-67, lo que indica un estado inactivo, así como por niveles más altos de CD38 (Fig. 3c) . ).

Figura 2
Fig. 2: La infección por SARS-CoV-2 provoca BMPC de larga duración que se unen a S.
figura 3
Fig. 3: Las BMPC que se unen al SARS-CoV-2 S están inactivas y son distintas de los plasmablastos circulantes.

Respuesta robusta de células B con memoria de unión a S

Las células B de memoria forman el segundo brazo de la memoria inmunitaria humoral. Después de la reexposición a un antígeno, las células B de memoria se expanden rápidamente y se diferencian en plasmablastos secretores de anticuerpos. Examinamos la frecuencia de células B de memoria circulantes específicas del SARS-CoV-2 en individuos que estaban convalecientes de COVID-19 y en individuos de control sanos. Teñimos PBMC con sondas S marcadas con fluorescencia y determinamos la frecuencia de las células B de memoria de unión a S entre las células B de memoria IgD lo CD20 + con cambio de isotipo mediante citometría de flujo. A modo de comparación, se tiñeron conjuntamente las células con sondas HA del virus de la influenza marcadas con fluorescencia (Fig. 4a , Datos extendidos Fig. 1d). Se identificaron células B de memoria de unión a S en individuos convalecientes en la primera muestra que se recogió aproximadamente un mes después del inicio de los síntomas, con frecuencias comparables a las de las células B de memoria de unión a HA de la influenza (Fig. 4b ). Las células B de memoria de unión a S se mantuvieron durante al menos 7 meses después de la aparición de los síntomas y estuvieron presentes con frecuencias significativamente más altas en relación con los controles sanos, comparables a las frecuencias de las células B de memoria de unión a HA de la influenza que se identificaron en ambos grupos (Fig. 4c ).

Figura 4
Fig. 4: La infección por SARS-CoV-2 provoca una respuesta robusta de células B de memoria.

Discusión

Este estudio buscó determinar si la infección con SARS-CoV-2 induce BMPCs de larga duración específicas de antígeno en humanos. Detectamos BMPC específicas de SARS-CoV-2 S en aspirados de médula ósea de 15 de 19 individuos convalecientes, y en ninguno de los 11 participantes de control. Las frecuencias de BMPC anti-S IgG se correlacionaron modestamente con los títulos de IgG sérica a los 7-8 meses después de la infección. El análisis fenotípico por citometría de flujo mostró que las BMPC de unión a S estaban inactivas y sus frecuencias eran en gran medida consistentes en 5 aspirados emparejados recogidos a los 7 y 11 meses después del inicio de los síntomas. En particular, no detectamos células de unión a S entre plasmablastos en muestras de sangre recolectadas al mismo tiempo que los aspirados de médula ósea por ELISpot o citometría de flujo en ninguna de las muestras convalecientes o de control. Juntos, estos datos indican que la infección leve por SARS-CoV-2 induce una respuesta de BMPC de larga duración. Además, demostramos que las células B de memoria que se unen a S en la sangre de las personas que se habían recuperado del COVID-19 estaban presentes en frecuencias similares a las dirigidas contra el virus de la influenza HA. En general, nuestros resultados son consistentes con la infección por SARS-CoV-2 que provoca una respuesta canónica de linfocitos B dependiente de linfocitos T, en la que un estallido transitorio temprano de plasmablastos extrafoliculares genera una ola de anticuerpos séricos que disminuyen con relativa rapidez. A esto le siguen niveles de anticuerpos séricos mantenidos de manera más estable que son respaldados por BMPC de larga duración. demostramos que las células B de memoria que se unen a S en la sangre de individuos que se habían recuperado de COVID-19 estaban presentes en frecuencias similares a las dirigidas contra el virus de la influenza HA. En general, nuestros resultados son consistentes con la infección por SARS-CoV-2 que provoca una respuesta canónica de linfocitos B dependiente de linfocitos T, en la que un estallido transitorio temprano de plasmablastos extrafoliculares genera una ola de anticuerpos séricos que disminuyen con relativa rapidez. A esto le siguen niveles de anticuerpos séricos mantenidos de manera más estable que son respaldados por BMPC de larga duración. demostramos que las células B de memoria que se unen a S en la sangre de individuos que se habían recuperado de COVID-19 estaban presentes en frecuencias similares a las dirigidas contra el virus de la influenza HA. En general, nuestros resultados son consistentes con la infección por SARS-CoV-2 que provoca una respuesta canónica de linfocitos B dependiente de linfocitos T, en la que un estallido transitorio temprano de plasmablastos extrafoliculares genera una ola de anticuerpos séricos que disminuyen con relativa rapidez. A esto le siguen niveles de anticuerpos séricos mantenidos de manera más estable que son respaldados por BMPC de larga duración.

Aunque esta tendencia general captura la dinámica de anticuerpos séricos de la mayoría de los participantes, observamos que en tres participantes, los títulos de anticuerpos séricos anti-S aumentaron entre 4 y 7 meses después del inicio de los síntomas, después de haber disminuido inicialmente entre 1 y 4 meses. Esto podría ser ruido estocástico, podría representar un aumento de la afinidad de unión neta a medida que los anticuerpos derivados de plasmablastos tempranos sean reemplazados por los de las BMPC maduradas por afinidad, o podría representar aumentos en la concentración de anticuerpos por el reencuentro con el virus (aunque ninguno de los participantes en nuestra cohorte dio positivo por segunda vez). Aunque los títulos de IgG anti-S en la cohorte de convalecientes fueron relativamente estables en el intervalo entre 4 y 11 meses después del inicio de los síntomas, disminuyeron de manera apreciable, en contraste con los títulos de las vacunas contra el virus de la influenza. Es posible que esta disminución refleje una disminución final de los anticuerpos derivados de plasmablastos tempranos. También es posible que la falta de disminución en los títulos de influenza se deba al aumento a través de la exposición a los antígenos de la influenza. Nuestros datos sugieren que la infección por SARS-CoV-2 induce una respuesta del centro germinal en humanos porque se cree que las BMPC de larga duración son predominantemente derivadas del centro germinal7 . Esto es consistente con un estudio reciente que informó niveles aumentados de hipermutación somática en las células B de memoria que se dirigen al RBD del SARS-CoV-2 S en individuos convalecientes a los 6 meses en comparación con 1 mes después de la infección 20 .

Hasta donde sabemos, el estudio actual proporciona la primera evidencia directa de la inducción de BMPC específicas de antígeno después de una infección viral en humanos. Sin embargo, reconocemos varias limitaciones. Aunque detectamos anticuerpos anti-S IgG en suero al menos 7 meses después de la infección en los 19 donantes convalecientes de los que obtuvimos aspirados de médula ósea, no pudimos detectar BMPC específicas de S en 4 donantes. Los títulos de anticuerpos séricos anti-S en esos cuatro donantes fueron bajos, lo que sugiere que las BMPC específicas de S pueden estar presentes potencialmente a frecuencias muy bajas que están por debajo del límite de detección del ensayo. Otra limitación es que no conocemos la fracción de las BMPC de unión a S detectadas en nuestro estudio que codifica anticuerpos neutralizantes. La proteína SARS-CoV-2 S es el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes 17 ,25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 y se ha documentado una correlación entre los títulos de neutralización y unión de anti-S IgG en suero 17 , 31 . Se requerirán más estudios para determinar los epítopos que son el objetivo de las BMPC y las células B de memoria, así como su relación clonal. Finalmente, aunque nuestros datos documentan una fuerte inducción de BMPC de larga duración después de la infección con SARS-CoV-2, es fundamental tener en cuenta que nuestros individuos convalecientes experimentaron principalmente infecciones leves. Nuestros datos son consistentes con un informe que muestra que las personas que se recuperaron rápidamente de la infección sintomática del SARS-CoV-2 generaron una sólida respuesta inmune humoral 32. Es posible que las infecciones más graves por SARS-CoV-2 puedan conducir a un resultado diferente con respecto a las frecuencias de BMPC de larga duración, debido a respuestas inmunes humorales desreguladas. Sin embargo, este no ha sido el caso de los supervivientes del brote del virus del Ébola de 2014 en África occidental, en quienes una infección viral grave indujo anticuerpos IgG séricos específicos de antígeno de larga duración 33 .

Las BMPC de larga duración proporcionan al huésped una fuente persistente de anticuerpos protectores preformados y, por lo tanto, son necesarias para mantener una protección inmunitaria duradera. Sin embargo, la longevidad de los anticuerpos séricos anti-S IgG no es el único determinante de cuán duradera será la protección inmunomediada. Las células B de memoria con cambio de isotipo pueden diferenciarse rápidamente en células secretoras de anticuerpos después de la reexposición a un patógeno, ofreciendo una segunda línea de defensa 34. Es alentador que la frecuencia de las células B de memoria circulantes que se unen a S a los 7 meses después de la infección fue similar a la de las células B dirigidas contra los antígenos HA de la influenza contemporánea. En general, nuestros datos proporcionan una fuerte evidencia de que la infección por SARS-CoV-2 en humanos establece de manera sólida los dos brazos de la memoria inmunitaria humoral: BMPC de larga duración y células B de memoria. Estos hallazgos proporcionan un punto de referencia de inmunogenicidad para las vacunas contra el SARS-CoV-2 y una base para evaluar la durabilidad de las respuestas inmunitarias humorales primarias que se inducen en humanos después de infecciones virales.

Métodos

Informe de datos

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no fueron cegados durante la evaluación de resultados.

Recolección, preparación y almacenamiento de muestras

Todos los estudios fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington en St Louis. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes. Se inscribieron 77 participantes que se habían recuperado de la infección por SARS-CoV-2 y once individuos de control sin antecedentes de infección por SARS-CoV-2 (Tablas de datos ampliadas 1 , 4). Se recogieron muestras de sangre en tubos con EDTA y se enriquecieron las PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll 1077 (GE) o Lymphopure (BioLegend). Los glóbulos rojos restantes se lisaron con tampón de lisis de cloruro de amonio y las células se usaron inmediatamente o se criopreservaron en dimetilsulfóxido al 10% en suero bovino fetal (FBS). Se recogieron aspirados de médula ósea de aproximadamente 30 ml en tubos con EDTA de la cresta ilíaca de 18 individuos que se habían recuperado de COVID-19 y los individuos de control. Las células mononucleares de médula ósea se enriquecieron mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll 1077, y los glóbulos rojos restantes se lisaron con tampón de cloruro de amonio (Lonza) y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con FBS al 2% y EDTA 2 mM.

Antígenos

La proteína espiga soluble recombinante (S) y su dominio de unión al receptor (RBD) derivado del SARS-CoV-2 se expresaron como se describió previamente 35. En resumen, secuencias de nucleótidos optimizadas por codones de células de mamíferos que codifican la versión soluble de S (GenBank: MN908947.3, aminoácidos (aa) 1–1,213) que incluyen un sitio de escisión de trombina C-terminal, dominio de trimerización del pliegue de T4 y etiqueta de hexahistidina clonada en el vector de expresión de mamífero pCAGGS. La secuencia de la proteína S se modificó para eliminar el sitio de escisión polibásico (RRAR a A) y se introdujeron dos mutaciones estabilizadoras (K986P y V987P, numeración de tipo salvaje). El RBD, junto con el péptido señal (aa 1-14) más una etiqueta de hexahistidina se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pCAGGS. Se produjeron proteínas recombinantes en células Expi293F (Thermo Fisher Scientific) mediante transfección con ADN purificado utilizando el kit de transfección ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific). Los sobrenadantes de las células transfectadas se recolectaron 3 (para S) o 4 (para RBD) días después de la transfección, y las proteínas recombinantes se purificaron usando agarosa Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific), luego se intercambiaron tampón en PBS y se concentraron usando filtros centrífugos Amicon Ultracel. (EMD Millipore). Para la tinción por citometría de flujo, el S recombinante se marcó con el éster Alexa Fluor 647 o DyLight 488-NHS (Thermo Fisher Scientific); Se eliminó el exceso de Alexa Fluor 647 y DyLight 488 usando columnas de desalación Zeba de 7 kDa y 40 kDa, respectivamente (Pierce). El HA recombinante de A / Michigan / 45/2015 (aa 18-529, Immune Technology) se marcó con el éster DyLight 405-NHS (Thermo Fisher Scientific); Se eliminó el exceso de DyLight 405 usando columnas de desalación Zeba de 7 kDa. HA recombinante de A / Brisbane / 02/2018 (aa 18-529) y B / Colorado / 06/2017 (aa 18-546) (ambas tecnologías inmunes) se biotinilaron utilizando el kit de biotinilación EZ-Link Micro NHS-PEG4 ( Thermo Fisher Scientific); El exceso de biotina se eliminó usando columnas de desalación Zeba de 7 kDa.

ELISpot

Las placas se recubrieron con la vacuna contra el virus de la influenza estacional Flucelvax Quadrivalent 2019/2020 (Sequiris), la vacuna contra el tétanos y la difteria (Grifols), S recombinante o Ig antihumana. El ELISpot directo ex vivo se realizó para determinar el número de células secretoras de IgG e IgA recombinantes que se unen a la vacuna o que se unen a S recombinantes presentes en muestras de BMPC y PBMC utilizando kits ELISpot de doble color IgG / IgA (tecnología celular) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. Las placas ELISpot se analizaron usando un contador ELISpot (Cellular Technology).

ELISA

Los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos (MaxiSorp, Thermo Fisher Scientific) recubiertas con 100 μl de Flucelvax 2019/2020 o S recombinante en PBS, y las placas se incubaron a 4 ° C durante la noche. A continuación, las placas se bloquearon con FBS al 10% y Tween-20 al 0,05% en PBS. El suero o el plasma se diluyeron en serie en tampón de bloqueo y se agregaron a las placas. Las placas se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con Tween-20 al 0,05% en PBS. Se diluyó IgG-HRP antihumana de cabra (Jackson ImmunoResearch, 1: 2500) en tampón de bloqueo antes de agregarlo a los pocillos e incubar durante 60 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con Tween-20 al 0,05% en PBS y luego se lavaron 3 veces con PBS antes de la adición de o-sustrato de peroxidasa de diclorhidrato de fenilendiamina (Sigma-Aldrich). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de HCl 1 M. Se tomaron medidas de densidad óptica a 490 nm. La dilución de unión semimáxima para cada muestra de suero o plasma se calculó mediante regresión no lineal (GraphPad Prism v.8). El límite de detección se definió como 1:30.

Estadísticas

Se estimaron los coeficientes de correlación de Spearman para evaluar la relación entre los títulos de IgG de las vacunas anti-S y anti-virus de la influenza a los 7 meses y las frecuencias de las BMPC que secretan IgG específicas para la vacuna S y contra el virus de la influenza, respectivamente. Las medias y las diferencias por pares de los títulos de anticuerpos en cada punto de tiempo se estimaron utilizando un análisis de modelo lineal mixto con una estructura de covarianza autorregresiva de primer orden. El tiempo transcurrido desde la aparición de los síntomas se trató como un efecto fijo categórico para los 4 puntos de tiempo de muestra diferentes espaciados aproximadamente con 3 meses de diferencia. Los  valores de p se ajustaron para comparaciones múltiples utilizando el método de Tukey. Todos los análisis se realizaron utilizando SAS v.9.4 (SAS Institute) y Prism v.8.4 (GraphPad), y los  valores de P inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Citometría de flujo

La tinción para el análisis de citometría de flujo se realizó utilizando BMPC enriquecidas magnéticamente crioconservadas y PBMC crioconservadas. Para la tinción de BMPC, las células se tiñeron durante 30 min en hielo con CD45-A532 (HI30, Thermo Fisher Scientific, 1:50), CD38-BB700 (HIT2, BD Horizon, 1: 500), CD19-PE (HIB19, 1: 200), CXCR5-PE-Dazzle 594 (J252D4, 1:50), CD71-PE-Cy7 (CY1G4, 1: 400), CD20-APC-Fire750 (2H7, 1: 400), CD3-APC-Fire810 (SK7 , 1:50) y Zombie Aqua (todos BioLegend) diluidos en tampón de tinción brillante (BD Horizon). Las células se lavaron dos veces con FBS al 2% y EDTA 2 mM en PBS (P2), se fijaron durante 1 h usando el kit de permeabilización True Nuclear (BioLegend), se lavaron dos veces con tampón de lavado permanente / permanente, se tiñeron durante 1 h con HA recombinante conjugada con DyLight 405 de A / Michigan / 45/2015, DyLight 488- y Alexa 647 conjugado S, Ki-67-BV711 (Ki-67, 1: 200, BioLegend) y BLIMP-1-A700 (646702, 1:50, R&D), se lavó dos veces con tampón de lavado permanente / y se resuspendió en P2. Para la tinción de células B de memoria, las PBMC se tiñeron durante 30 min en hielo con HA recombinantes biotinilados diluidos en P2, se lavaron dos veces y luego se tiñeron durante 30 min en hielo con S, IgA-FITC conjugado con Alexa 647 (M24A, Millipore, 1: 500). ), IgG-BV480 (policlonal de cabra, Jackson ImmunoResearch, 1: 100), IgD-SB702 (IA6-2, Thermo Fisher Scientific, 1:50), CD38-BB700 (HIT2, BD Horizon, 1: 500), CD20- Azul Pacífico (2H7, 1: 400), CD4-BV570 (OKT4, 1:50), CD24-BV605 (ML5, 1: 100), estreptavidina-BV650, CD19-BV750 (HIB19, 1: 100), CD71-PE (CY1G4, 1: 400), CXCR5-PE-Dazzle 594 (J252D4, 1:50), CD27-PE-Cy7 (O323, 1: 200), IgM-APC-Fire750 (MHM-88, 1: 100), CD3-APC-Fire810 (SK7, 1:50) y Zombie NIR (todos BioLegend) diluidos en tampón de tinción brillante (BD Horizon) y lavados dos veces con P2. Las células se adquirieron en un Aurora usando SpectroFlo v.2.2 (Cytek). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo v.10 (Treestar). En cada experimento, se incluyeron PBMC de individuos convalecientes e individuos de control.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el  Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento.

Disponibilidad de datos

Los datos relevantes están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Referencias

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Descargar referencias

Acknowledgements

We thank the donors for providing specimens; T. Lei for assistance with preparing specimens; and L. Kessels, A. J. Winingham, the staff of the Infectious Diseases Clinical Research Unit at Washington University School of Medicine and the nursing team of the bone marrow biopsy suite at Washington University School of Medicine and Barnes Jewish Hospital for sample collection and providing care for donors. The SARS-CoV-2 S and RBD protein expression plasmids were provided by F. Krammer. The Ellebedy laboratory was supported by National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) grants U01AI141990 and 1U01AI150747, NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance contracts HHSN272201400006C and HHSN272201400008C and NIAID Collaborative Influenza Vaccine Innovation Centers contract 75N93019C00051. J.S.T. was supported by NIAID 5T32CA009547. L.H. was supported by Norwegian Research Council grant 271160 and National Graduate School in Infection Biology and Antimicrobials grant 249062. This study used samples obtained from the Washington University School of Medicine’s COVID-19 biorepository, which is supported by the NIH–National Center for Advancing Translational Sciences grant UL1 TR002345. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the view of the NIH. The WU353, WU367 and WU368 studies were reviewed and approved by the Washington University Institutional Review Board (approval nos. 202003186, 202009100 and 202012081, respectively).

Información del autor

Afiliaciones

  1. Departamento de Patología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Jackson S. Turner, Wooseob Kim, Aaron J. Schmitz, Lena Hansen y Ali H. Ellebedy
  2. División de Alergia e Inmunología, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Elizaveta Kalaidina
  3. División de Bioestadística, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Charles W. Goss
  4. División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Adriana M. Rauseo, Jane A. O’Halloran y Rachel M. Presti
  5. Centro de Influenza, Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Bergen, Bergen, NoruegaLena Hansen
  6. Unidad de Ensayos Clínicos, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Alem Haile y Michael K. Klebert
  7. División de Oncología, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Iskra Pusic
  8. Centro de Vacunas e Inmunidad a Patógenos Microbianos, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Rachel M. Presti y Ali H. Ellebedy
  9. El Centro Andrew M. y Jane M. Bursky para Programas de Inmunología e Inmunoterapia Humana, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.Ali H. Ellebedy

Contribuciones

AHE concibió y diseñó el estudio. JST y AHE diseñaron experimentos y compusieron el manuscrito. AH, MKK, IP, JAO y RMP redactaron y mantuvieron el protocolo de la Junta de Revisión Institucional, reclutaron y flebotomizaron participantes y coordinaron la recolección de muestras. Muestras procesadas JST, WK, EK, AJS y ​​LH. AJS expresó proteínas S y RBD. JST, WK y EK realizaron ELISA y ELISpot. JST realizó citometría de flujo. JST, AMR, CWG y AHE analizaron los datos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Autor correspondiente

Correspondencia a Ali H. Ellebedy .

Declaraciones de ética

Conflicto de intereses

El laboratorio de Ellebedy recibió financiación en virtud de acuerdos de investigación patrocinados que no están relacionados con los datos presentados en el estudio actual de Emergent BioSolutions y de AbbVie. JST, AJS y ​​AHE son beneficiarios de un acuerdo de licencia con Abbvie que no está relacionado con los datos presentados en el estudio actual. AHE es consultor de Mubadala Investment Company y fundador de ImmuneBio Consulting. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Información adicional

Información de la revisión por pares Nature agradece a Stanley Perlman, Andreas Radbruch y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Figuras y tablas de datos ampliados

Datos extendidos Fig. 1 Identificación por citometría de flujo de células plasmáticas y células B de memoria provocadas por el SARS-CoV-2.

a , d , Estrategias de activación de citometría de flujo para BMPC en BMPC enriquecidas magnéticamente y plasmablastos en PBMC ( a ) y células B de memoria con cambio de isotipo y plasmablastos en PBMC ( d ). b , Gráficos representativos de tinción intracelular de SARS-CoV-2 S y virus de influenza HA en BMPC de muestras de individuos de control (izquierda) e individuos que estaban convalecientes de COVID-19 (derecha) 7 meses después del inicio de los síntomas. c , Gráficos representativos de tinción intracelular S en plasmablastos en PBMC una semana después de la vacunación contra el virus de la influenza estacional o SARS-CoV-2.Tabla de datos ampliados 1 Datos demográficos de los pacientes con COVID-19Mesa de tamaño completoTabla de datos ampliados 2 Síntomas de pacientes con COVID-19Mesa de tamaño completoTabla de datos ampliados 3 Síntomas y muestras de seguimiento (meses 4 a 11) de individuos convalecientesMesa de tamaño completoTabla de datos extendidos 4 Datos demográficos de control saludableMesa de tamaño completo

Información suplementaria

Resumen de informes

Archivo de revisión por pares

Reimpresiones y permisos

Citar este artículo

Turner, JS, Kim, W., Kalaidina, E. et al. La infección por SARS-CoV-2 induce células plasmáticas de médula ósea de larga duración en humanos. Nature 595, 421–425 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03647-4

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