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Una empresa de biotecnología de California llamada Senomyx se especializa en el desarrollo de saborizantes alimentarios utilizando células embrionarias abortadas para la producción de productos químicos alimentarios. La investigación de Senomyx sobre el uso de células fetales humanas abortadas «HEK-293» como potenciador del sabor se publicó en pubmed en 2002, después de lo cual presentaron varias patentes. Además, esta empresa se ha asociado con numerosos fabricantes importantes de alimentos procesados, incluidos Kraft, PepsiCo y Nestlé”.
Células HEK 293
Patente: Métodos recombinantes para expresar un receptor de sabor dulce funcional utilizando células Hek293 , de la empresa Firmenich dueña de Senomyx.
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Aplicación US10/725,472 eventos2001-03-07Prioridad a US09/799,6292003-12-03Solicitud presentada por Senomyx Inc.2004-09-30Publicación de US20040191862A12008-03-18
Solicitud concedida2008-03-18Publicación de US7344859B2Estado
Activo2022-12-02
InformaciónCitas de patentes (40)Citas no relacionadas con patentes (21)Citado por (105)Eventos legalesDocumentos similaresSolicitudes prioritarias y relacionadas enlaces externosUSPTOCentro de Patentes de la USPTOAsignación de la USPTOEspacenetDossier GlobalConversar
Descripción
REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADASEsta aplicación es una división de EE.UU. Ser. No. 10/179,373, presentada el 26 de junio de 2002, que es una continuación en parte de la US Ser. Nº 10/035.045, presentada el 3 de enero de 2002, ahora patente de EE.UU. n.º 7.241.880, serie de EE. UU. Nº 09/897.427, ahora patente de EE.UU. No. 6,955,887, presentada el 3 de julio de 2001, y US Ser. Nº 09/799.629, presentada el 7 de marzo de 2001, ahora patente de EE.UU. Nº 7.244.835; EE.UU. Ser. Nº 10/179.373 reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional Ser. No. 60/300,434, presentada el 26 de junio de 2001, solicitud provisional de EE. UU. Nº 60/304.749 presentada el 13 de julio de 2001, solicitud provisional de EE.UU. No. 60/310,493 presentada el 8 de agosto de 2001, US Provisional Application Ser. No. 60/331,771 presentada el 21 de noviembre de 2001, US Provisional Application Ser. No. 60/339,472 presentada el 14 de diciembre de 2001, y US Provisional Ser. No. 60/372,090 presentada el 15 de abril de 2002 y US Serie de solicitud provisional Nº 60/374.143 presentada el 22 de abril de 2002, todas las cuales se incorporan por referencia en su totalidad.ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN1. Campo de la invenciónLa presente invención se refiere en parte al descubrimiento de que los receptores T1R se ensamblan para formar receptores gustativos funcionales. En particular, se ha descubierto que la coexpresión de T1R1 y T1R3 da como resultado un receptor gustativo que responde a los estímulos gustativos umami, incluido el glutamato monosódico. Además, se ha descubierto que la coexpresión de los receptores T1R2 y T1R3 da como resultado un receptor del gusto que responde a los estímulos del gusto dulce, incluidos los edulcorantes naturales y artificiales.También la presente invención se refiere al uso de receptores de sabor heterooligoméricos que comprenden T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 en ensayos para identificar compuestos que responden respectivamente a estímulos de sabor umami y estímulos de sabor dulce.Además, la invención se refiere a la construcción de líneas celulares que coexpresan de manera estable o transitoria una combinación de T1R1 y T1R3; o T1R2 y T1R3; bajo condiciones constitutivas o inducibles.También se proporciona el uso de estas líneas celulares en ensayos basados en células para identificar umami y compuestos moduladores del sabor dulce, en particular ensayos de detección de alto rendimiento que detectan la actividad del receptor mediante el uso de imágenes fluorométricas.2. Descripción de la técnica relacionadaEl sistema gustativo proporciona información sensorial sobre la composición química del mundo exterior. Se cree que los mamíferos tienen al menos cinco modalidades básicas de sabor: dulce, amargo, agrio, salado y umami. Véase, por ejemplo, Kawamura et al.,
Introducción a Umami: A Basic Taste (1987); Kinnamon y col.,
Ann. Rev. Physiol ., 54:715-31 (1992);
Lindemann, Physiol. Rev. , 76:718-66 (1996); Stewart y col.,
Am. J. Physiol., 272:1-26 (1997). Se cree que cada modalidad gustativa está mediada por un receptor o receptores proteicos distintos que se expresan en células receptoras gustativas que se encuentran en la superficie de la lengua (Lindemann, Physol. Rev. 76:718-716 (1996)). Los receptores gustativos que reconocen estímulos gustativos amargos, dulces y umami pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) (Hoon et al.,
Cell 96:451 (1999); Adler et al.,
Cell 100:693 ( 2000)). (Se cree que otras modalidades gustativas están mediadas por canales iónicos).Los receptores acoplados a proteína G median muchas otras funciones fisiológicas, como la función endocrina, la función exocrina, la frecuencia cardíaca, la lipólisis y el metabolismo de los carbohidratos. El análisis bioquímico y la clonación molecular de varios de tales receptores ha revelado muchos principios básicos con respecto a la función de estos receptores. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.691.188 describe cómo tras la unión de un ligando a un GPCR, el receptor sufre un cambio conformacional que conduce a la activación de una proteína G heterotrimérica al promover el desplazamiento del GDP unido por GTP en la superficie de la subunidad Gα y la subsiguiente disociación de la subunidad Gα. de las subunidades Gβ y Gγ. Las subunidades Gα libres y los complejos Gβγ activan elementos aguas abajo de una variedad de vías de transducción de señales.Esta invención se refiere a la clase T1R de tres miembros de GPCR específicos de sabor. Anteriormente, se planteó la hipótesis de que los receptores T1R funcionaban como receptores de sabor dulce (Hoon et al.,
Cell 96:541-51 (1999); Kitagawa et al.,
Biochem Biophys Res. Commun . 283:236-42 (2001); Max y col.,
Nat. Genet . 28:58-63 (2001), Montmayeur y col.,
Nat. Neurosci . 4: 412-8 (2001), Sainz y col.,
J. Neurochem. 77: 896-903 (2001)), y Nelson et al. (2001) han demostrado recientemente que T1R2 y T1R3 de rata actúan en combinación para reconocer estímulos de sabor dulce. La presente invención se refiere a dos descubrimientos. Primero, como es el caso de T1R2/T1R3 de rata, T1R2 y T1R3 humanos actúan en combinación para reconocer estímulos de sabor dulce. En segundo lugar, T1R1 y T1R3 humanos actúan en combinación para reconocer los estímulos gustativos umami. Por lo tanto, es probable que T1R2/T1R3 funcione como un receptor de sabor dulce y que T1R1/T1R3 funcione como un receptor de sabor umami en mamíferos. La explicación probable para la codependencia funcional de T1R1 y T1R3 y la codependencia funcional de T1R2 y T1R3 es que, al igual que el receptor GABA
Bestructuralmente relacionado (Jones et al.,
Nature396: 5316-22 (1998); Kaupmann y col.,
Nature 396: 683-7 (1998); White y col.,
Nature396:679-82 (1998); Kuner et al.,
Science 283: 74-77 (1999)), los T1R funcionan como complejos heterodiméricos. Sin embargo, es posible alternativamente que esta codependencia funcional refleje una interacción necesaria pero transitoria que finalmente produce receptores del gusto monoméricos u homomultiméricos funcionalmente independientes.La identificación de la caracterización de los receptores del gusto que funcionan como receptores dulces y umami es importante ya que facilitará el uso de estos receptores en ensayos para identificar compuestos que modulan (mejoran o bloquean) el sabor dulce y umami. Estos compuestos serían útiles para mejorar el sabor y palatabilidad de alimentos, bebidas, medicamentos para consumo humano o animal. En particular, un ensayo que utilice un receptor dulce funcional permitiría la identificación de nuevos edulcorantes.SUMARIO DE LA INVENCIÓNLa presente invención se refiere al descubrimiento de que diferentes combinaciones de T1R, cuando se coexpresan, producen receptores gustativos funcionales que responden a estímulos gustativos. En particular, la presente invención se refiere al descubrimiento de que la coexpresión de T1R2 y T1R3 da como resultado un receptor de sabor heterooligomérico que responde a estímulos de sabor dulce. Además, la presente invención se refiere al descubrimiento de que la coexpresión de T1R1 y T1R3 da como resultado un receptor gustativo heterooligomérico que responde a los estímulos gustativos umami, como el glutamato monosódico.La presente invención también se refiere a líneas celulares que coexpresan T1R1 y T1R3, preferentemente humana, o T1R2 y T1R3, preferentemente humana. En realizaciones preferidas, estas líneas celulares expresarán cantidades elevadas de los receptores, ya sea de forma constitutiva o inducible. Estas líneas celulares incluyen células que expresan de forma transitoria o estable T1R1 y T1R3 o T1R2 y T1R3.Además, la presente invención proporciona ensayos, preferiblemente ensayos de detección de alto rendimiento, que utilizan el receptor de sabor T1R2/T1R3, o el receptor T1R1/T1R3, preferiblemente ensayos basados en células de alto rendimiento, para identificar compuestos que modulan el sabor dulce o umami. La invención también proporciona ensayos que incluyen pruebas de sabor para confirmar que estos compuestos modulan el sabor dulce o umami.OBJECIONES DE LA INVENCIÓNCon ese fin, es un objeto de la invención proporcionar una familia de receptores acoplados a proteínas G de mamíferos, denominados aquí T1R, que median la percepción del gusto.Es otro objeto de la invención proporcionar fragmentos y variantes de dichos T1R que retengan la actividad, por ejemplo, que se activen y/o se unan a estímulos de sabor dulce o umami.Otro objeto más de la invención es proporcionar secuencias de ácido nucleico o moléculas que codifiquen dichos T1R, fragmentos o variantes de los mismos.Todavía otro objeto de la invención es proporcionar vectores de expresión que incluyan secuencias de ácido nucleico que codifiquen dichos T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, que estén unidos operativamente a al menos una secuencia reguladora, como un promotor, potenciador u otra secuencia involucrada en transcripción y/o traducción de genes positivos o negativos, y/o exportación de proteínas.Todavía otro objeto de la invención es proporcionar células humanas o no humanas, por ejemplo, células de mamífero, levadura, gusano o insecto, que expresen funcionalmente al menos uno de tales T1R, o fragmentos o variantes de los mismos y preferiblemente una combinación de T1R. o fragmentos o variantes de los mismos.Todavía otro objeto de la invención es proporcionar proteínas o polipéptidos de fusión de T1R que incluyen al menos un fragmento de al menos uno de dichos T1R.Es otro objeto de la invención proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido T1R que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50%, preferiblemente 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico que tiene una de las secuencias de ácido nucleico de hT1R identificadas a continuación, y variantes de la misma modificadas de forma conservadora.Es un objeto adicional de la invención proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 35 a 50 %, y preferiblemente 60 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de una de las secuencias de aminoácidos de T1R identificadas a continuación y variantes de la misma modificadas de forma conservadora, en las que el fragmento es al menos 20, preferiblemente 40, 60, 80, 100, 150, 200 o 250 aminoácidos de longitud. Opcionalmente, el fragmento puede ser un fragmento antigénico que se une a un anticuerpo anti-T1R.Todavía es un objeto adicional de la invención proporcionar un polipéptido aislado que comprende una variante de dicho fragmento, en el que hay una variación en un máximo de 10, preferiblemente 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos.Otro objeto de la invención es proporcionar combinaciones de T1R1/T1R3 en las que T1R1 y/o T1R3 son una variante o un fragmento, y combinaciones de T1R2/T1R3 en las que T1R2 y/o T1R3 son una variante o un fragmento.Todavía otro objeto de la invención es proporcionar agonistas o antagonistas de dichos T1R, o fragmentos o variantes de los mismos.Todavía es otro objeto de la invención proporcionar un péptido que interactúa con el dominio PDZ (en el presente documento denominado PDZIP) que puede facilitar la expresión superficial de proteínas integrales de la membrana plasmática, específicamente GPCR tales como los T1R. También es un objeto de la invención proporcionar vectores que incluyen PDZIP, células huésped que expresan tales vectores y métodos para usar PDZIP para facilitar la expresión en la superficie.Es un objeto preferido de la invención proporcionar ensayos, especialmente ensayos de alto rendimiento, para identificar compuestos moduladores del sabor, particularmente compuestos moduladores del sabor dulce y umami. Preferiblemente, dichos ensayos utilizarán una combinación de T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, o genes que codifican dichos T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, que se describen en el presente documento. Más preferiblemente tales combinaciones comprenderán hT1R1/hT1R3 y hT1R2/hT1R3.Es una realización especialmente preferida de la invención identificar compuestos que modulan los receptores del gusto T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, por ejemplo, que mejoran la capacidad de estos receptores para responder a los estímulos del gusto. Por ejemplo, como se describe a continuación, se ha descubierto que 5′-IMP o 5′-GMP mejora la capacidad de respuesta del umami (T1R1/T1R3) al L-glutamato. Estos compuestos moduladores pueden mejorar la actividad de diferentes estímulos de sabor dulce o umami, y proporcionar sabores mejorados y/o que se provoque el mismo sabor a una concentración reducida del compuesto que provoca el sabor dulce o umami particular, cuya actividad es mejorada por un modulador del gusto identificado usando los ensayos en cuestión.Todavía es un objeto adicional de la invención proporcionar ensayos preferidos para evaluar uno o más compuestos para un sabor que comprende: un paso de poner en contacto dicho uno o más compuestos con al menos uno de los T1R divulgados, fragmentos o variantes de los mismos, preferiblemente combinaciones de T1R humanos.Es un objeto más específico de la invención proporcionar un método para seleccionar uno o más compuestos por su capacidad para mejorar, imitar, bloquear y/o modular la percepción del sabor dulce, en un mamífero, preferiblemente humano, que comprende un paso de poner en contacto uno o más más compuestos con una combinación de hT1R2 y hT1R3 o un complejo que comprende un fragmento, quimera o variante de hT1R2 y/o hT1R3.Es otro objeto específico de la invención proporcionar un método para seleccionar uno o más compuestos por su capacidad para mejorar, imitar, bloquear y/o modular la percepción del gusto, especialmente la percepción del gusto umami en un mamífero, preferiblemente humano, que comprende un paso de contacto dicho uno o más compuestos con una combinación de hT1R1 y hT1R3, o un complejo que comprende un fragmento, quimera o variante de hT1R1 y hT1R3.Es otro objeto específico de la invención producir células que coexpresan hT1R2 y hT1R3, o un fragmento, variante o quimera de las mismas, para usar en la identificación de compuestos que mejoran, imitan, bloquean y/o modulan la percepción del gusto, especialmente la percepción del gusto dulce. .Otro objeto específico de la invención es producir células que coexpresan hT1R1 y hT1R3 o un fragmento, variante o quimera de las mismas para su uso en ensayos para identificar compuestos que mejoran, imitan, bloquean y/o modulan la percepción del gusto, especialmente la percepción del gusto umami. .Es otro objeto de la invención producir animales no humanos que han sido modificados genéticamente para expresar o no expresar uno o más T1R.Otro objeto más de la invención es utilizar un compuesto identificado usando un ensayo que utiliza T1R, o una combinación de los mismos, como ingredientes de sabor en composiciones de alimentos y bebidas. En particular, es un objeto de la invención utilizar un compuesto que interactúa con hT1R2 y/o hT1R3 como bloqueador dulce, potenciador, modulador o imitador, y un compuesto que interactúa con hT1R1 y/o hT1R3 como bloqueador umami. potenciador, modulador o imitador en composiciones de alimentos y bebidas.Es otro objeto de la invención usar T1R, en particular T1R no humanos, para identificar compuestos que modulan el sabor de las formulaciones de alimentos para animales para usar, por ejemplo, en acuicultura.Es un objeto preferido de la invención proporcionar líneas celulares eucarióticas, preferiblemente de mamíferos o de insectos, que coexpresen establemente hT1R1/hT1R3 o hT1R2/hT1R3, preferiblemente líneas celulares HEK-293, que también expresen una proteína G, por ejemplo, G
α15 o otra proteína G que cuando se expresa en asociación con T1R2/T1R3 o T1R1/T1R3 produce un receptor gustativo funcional.Es otro objeto preferido de la invención proporcionar líneas de células eucarióticas, preferiblemente células de mamífero o de insecto, que expresen de manera estable T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, preferiblemente hT1R1/hT1R3 o hT1R2/hT1R3. En una realización preferida, dichas células comprenderán células HEK-293 que expresan de manera estable G
α15 u otra proteína G que se asocia con T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3 para producir un receptor funcional umami o de sabor dulce.También es un objeto de la invención proporcionar ensayos, preferiblemente ensayos de alto rendimiento usando HEK-293 u otras líneas celulares que expresen de manera estable o transitoria T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, en condiciones constitutivas o inducibles para identificar compuestos que modulan umami o dulce. gusto.Es otro objeto específico de la invención identificar compuestos que mejoren, imiten, bloqueen y/o modulen el receptor del gusto umami T1R1/T1R3 en función de su capacidad para afectar la unión de lactisol (un inhibidor del sabor dulce) o un compuesto estructuralmente relacionado para el receptor del gusto T1R1/T1R3 (umami).BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASFIGURAS. 1
a –
1 b contienen un alineamiento de secuencias de T1R humano (SEQ ID NOS 5-7) y de rata (SEQ ID NOS 16-17 y 4), receptor sensor de calcio humano (SEQ ID NO: 19) y receptor de glutamato metabotrópico de rata ( SEC ID Nº: 18).HIGO. 2 contiene resultados experimentales de amplificación de RT-PCR que muestran que hT1R2 y hT1R3 se expresan en el tejido gustativo.FIGURAS. 3
a – 3c contienen datos relacionados con las respuestas
de los receptores a los estímulos de sabor dulce. FIGURAS. 3
a –
3 bcontienen datos funcionales (respuestas de calcio intracelular) provocados por diferentes estímulos de sabor dulce en células HEK que expresan de forma estable G
α15 que se transfectan transitoriamente con T1R2, T1R3 y T1R2/T1R3 humanos a diversas concentraciones de estímulos de sabor dulce (HIGO. 3
un ); respuesta a la dosis de T1R2/T1R3 humano para varios estímulos de sabor dulce (HIGO. 3
b ); respuestas T1R2/T1R3 humanas a la sacarosa en presencia de gurmarina, y respuestas endógenas del receptor β2-adrenérgico al isoproterenol en presencia de gurmarina. HIGO. 3
c contiene la respuesta normalizada a diferentes edulcorantes.HIGO. 4 contiene respuestas de calcio intracelular en células HEK que expresan de forma estable G
α15 , transfectadas transitoriamente con hT1R2/hT1R3, rT1R2/rT1R3, hT1R2/rT1R3 y rT1R2/hT1R3 en respuesta a sacarosa 350 mM, triptófano 25 mM, aspartamo 15 mM y monelina al 0,05 %.HIGO. 5 contiene los resultados de un ensayo basado en un reactor de placa de fluorescencia en el que las células HEK que expresan Gα
15 deforma estable se transfectaron transitoriamente con hT1R2 y hT1R3 o hT1R3 solo y se pusieron en contacto con el colorante de calcio Fluo-4 y un estímulo de sabor dulce (ciclamato 12,5 mM).HIGO. 6 contiene curvas dosis-respuesta normalizadas que muestran que hT1R2 y hT1R3 funcionan en combinación como el receptor dulce humano en función de su interacción dosis-específica con varios estímulos dulces (trp, ciclamato, sacarosa, neotamo, asparamo, sacarina y Acek).HIGO. 7 contiene información estructural relacionada con mGluR1 y T1R1 que muestra los residuos clave de unión al ligando que se observan en estas moléculas.FIGURAS. 8
a –
8 c contienen datos funcionales que muestran que las células HEK que expresan de manera estable Gα
15 que se transfectan transitoriamente con T1R1/T1R3 responden al glutamato en un ensayo basado en calcio intracelular. HIGO. 8
a muestra que el calcio intracelular aumenta en respuesta al aumento de la concentración de glutamato; HIGO. 8
bmuestra que el calcio intracelular responde a IMP (2 mM), glutamato (0,5 mM) e IMP 0,2 mM; y HIGO. 8
c muestra respuestas T1R1/T1R3 humanas para glutamato en presencia y ausencia de IMP 0,2 mM.FIGURAS. 9
a –
9 b , respectivamente, contienen los resultados de un ensayo de tinción de inmunofluorescencia usando hT1R2 marcado con Myc y un experimento FACS que muestra que la incorporación del péptido PDZIP (SEQ ID No: 1) mejoró la expresión de un T1R (hT1R2) en el membrana de plasma.FIGURAS. 10A-10L contienen datos de imágenes de calcio que demuestran que hT1R2/hT1R3 responden a diferentes estímulos dulces.HIGO. 11 muestra las respuestas de líneas celulares que expresan de manera estable hT1R1/hT1R3 mediante imágenes de fluorescencia automatizadas a estímulos gustativos umami.HIGO. 12 muestra las respuestas de una línea celular que expresa de manera estable hT1R2/hT1R3 mediante imágenes de fluorescencia automatizadas a estímulos de sabor dulce.HIGO. 13 muestra las curvas de dosis-respuesta determinadas utilizando imágenes de fluorescencia automatizadas para una línea celular que expresa induciblemente el receptor de sabor humano T1R1/T1R3 para L-glutamato en presencia y ausencia de IMP 0,2 mM.FIGURAS. 14 y 15 muestran la respuesta de una línea celular que expresa induciblemente el receptor del gusto T1R1/T1R3 humano (clon I-17) a un panel de L-aminoácidos. En HIGO. 14 Se ensayaron diferentes C-aminoácidos a 10 mM en presencia y ausencia de IMP 1 mM. En HIGO. 15las dosis-respuesta para los aminoácidos activos se determinaron en presencia de IMP 0,2 mM.FIGURAS. 16A y 16B muestran que el lactisol inhibe las actividades del receptor de T1R2/T1R3 humano y T1R1/T1R3 humano. HIGO. 16Amuestra las respuestas de HEK-Gα
15 , células transfectadas transitoriamente con T1R1/T1R3 (círculos) a L-glutamato 10 mM y HEK-Gα
15 , transfectadas transitoriamente con T1R2/T1R3 (cuadrados) a sacarosa 150 mM en presencia de concentraciones variables de lactisol HIGO. 16Bmuestra aumentos en los umbrales de detección del sabor en presencia de lactisol 1 y 2 mM para los estímulos de sabor dulce sacarosa y D-triptófano, los estímulos de sabor umami L-glutamato (MSG) y L-glutamato más IMP 0,2 mM y cloruro de sodio. Los umbrales de detección se determinaron siguiendo el método de Schiffman et al.DESCRIPCIÓN DETALLADA DE EL INVENTOPor lo tanto, la invención proporciona receptores del gusto funcionales, preferiblemente receptores del gusto humanos, que se producen mediante la coexpresión de una combinación de diferentes T1R, preferiblemente T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, y las correspondientes secuencias o fragmentos de ácido nucleico aislado, quimeras o variantes. de los mismos que tras la coexpresión dan como resultado un receptor gustativo funcional, es decir, un receptor gustativo dulce (T1R2/T1R3) o un receptor gustativo umami (T1R1/T1R3).Como se ha informado en la literatura, los miembros de la familia T1R de GPCR específicos de células del gusto se conocen y se identifican en Hoon et al.,
Cell , 96: 541-551 (1999), WO 00/06592, WO 00/06593 , y EE.UU. Ser. No. 09/799,629, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.Más particularmente, la invención se refiere a la coexpresión de diferentes GPCR específicos de células gustativas. Estos ácidos nucleicos y los receptores que codifican se conocen como miembros de la familia «T1R» de GPCR específicos de células gustativas. En realizaciones particulares de la invención, los miembros de la familia T1R que se coexpresan incluirán rT1R1, rT1R2, rT1R3, mT1R1, mT1R2, mT1R3, hT1R1, hT1R2 y hT1R3. Si bien no deseamos limitarnos a la teoría, se cree que estos GPCR específicos de células gustativas son componentes de la ruta de transducción del gusto y están involucrados en la detección del gusto de estímulos gustativos dulces y umami y/u otros estímulos gustativos que representan otros gustos. modalidades.Se establece aquí que los miembros de la familia T1R actúan en combinación con otros miembros de la familia T1R para funcionar como receptores de sabor dulce y umami. Como se describe con mayor detalle más adelante en los ejemplos experimentales, se ha demostrado que las células heterólogas que coexpresan hT1R2 y hT1R3 se activan selectivamente mediante estímulos de sabor dulce de una manera que refleja el sabor dulce humano. Por ejemplo, las células HEK-293-Gα15 que coexpresan hT1R2 y hT1R3 responden específicamente al ciclamato, la sacarosa, el aspartamo y la sacarina, y las respuestas a la dosis de estos compuestos se correlacionan con los umbrales psicofísicos de detección del gusto. Por lo tanto, las células que coexpresan hT1R2 y hT1R3 se pueden utilizar en cribados, preferentemente cribados de alto rendimiento, para identificar compuestos que imitan, modulan, bloquean y/o potencian la sensación de sabor dulce.Además, como respaldan los datos de los ejemplos experimentales, se ha demostrado que las células que coexpresan hT1R1 y hT1R3 se activan selectivamente por glutamato (glutamato monosódico) y 5′-ribonucleótidos de una manera que refleja el gusto umami humano. Por ejemplo, las células HEK-293-Gα15 que coexpresan hT1R1 y hT1R3 responden específicamente al glutamato y la respuesta a la dosis de este compuesto con sabor a umami se correlaciona con su umbral psicofísico de detección del sabor. Además, los 5′-ribonucleótidos como IMP mejoran la respuesta de glutamato del receptor T1R1/T1R3, un sinergismo característico del sabor umami. Por lo tanto, las células que coexpresan hT1R1 y hT1R3 se pueden usar en cribados, preferentemente cribados de alto rendimiento para identificar compuestos que imitan, modulan, bloquean y/o potencian la sensación del gusto umami.Además, como muestran los datos experimentales en los ejemplos, se ha demostrado que las células que coexpresan de forma estable e inducible T1R1/T1R3 responden selectivamente a los estímulos gustativos umami L-glutamato y L-aspartato y solo responden débilmente a otros L-aminoácidos. , y en concentraciones mucho más altas, lo que proporciona evidencia adicional de que el receptor T1R1/T1R3 puede usarse en ensayos para identificar compuestos que modulan (mejoran o bloquean) los estímulos gustativos umami.Además, como lo respaldan los datos experimentales en los ejemplos, se ha demostrado que las líneas celulares que coexpresan T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, respectivamente, responden a estímulos de sabor dulce o umami y una forma cuantitativa de respuesta a la dosis que respalda aún más la conclusión de que el receptor T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 se puede usar para identificar agonistas y antagonistas del receptor, por ejemplo, sustitutos de MSG, bloqueadores umami, nuevos edulcorantes artificiales y naturales y bloqueadores dulces.Además, tal como lo respaldan los datos de los ejemplos experimentales, se ha demostrado que el bloqueador del sabor dulce lactisol inhibe tanto el receptor de dulce T1R2/T1R3 como el receptor de sabor umami T1R1/T1R3. Esto sugiere que los ensayos que detectan compuestos que afectan la unión de lactisol a T1R2/T1R3 o T1R1/T1R3 pueden usarse para identificar compuestos que mejoran, imitan, modulan o bloquean el sabor dulce o umami. El hecho de que el lactisol inhiba los receptores T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 sugiere que estos receptores pueden compartir una subunidad común que se une al lactisol y potencialmente a otros moduladores del gusto. Por lo tanto, esto sugiere que algunos compuestos que mejoran, imitan, modulan o bloquean el sabor dulce pueden tener un efecto similar en el sabor umami o viceversa.Además, como lo respaldan los datos de los ejemplos experimentales, se ha demostrado que las líneas celulares que coexpresan de forma estable los T1R, es decir, T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, cuando se analizan mediante imágenes de fluorescencia automatizadas, responden de manera muy eficaz a varios estímulos de sabor dulce y umami. es decir, en magnitudes sustancialmente mayores que las células transfectadas transitoriamente. Por lo tanto, estas líneas celulares son especialmente adecuadas para su uso en ensayos de selección de alto rendimiento para identificar compuestos que modulan, bloquean, imitan o mejoran el sabor dulce o umami. Sin embargo, la invención también abarca ensayos que utilizan células que expresan transitoriamente un T1R o una combinación de los mismos.Además, aunque la solicitud contiene datos que demuestran que algunos T1R actúan en combinación, particularmente T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3, y que tales combinaciones de receptores pueden usarse en ensayos, preferiblemente ensayos de alto rendimiento, se debe señalar que la presente invención también abarca ensayos que utilizan T1R1, T1R2 y T1R3 solos o en combinación con otras proteínas, por ejemplo, otros GPCR.Con respecto a esto, se especula que los receptores dulces pueden estar compuestos solo por T1R2 y/o que el receptor umami puede estar compuesto solo por T1R1, con el receptor T1R3 quizás funcionando para facilitar la expresión superficial de T1R2 o T1R1.Alternativamente, se plantea la hipótesis de que el receptor dulce y el receptor umami pueden estar compuestos solo por T1R3, que puede procesarse de forma diferente bajo el control de T1R1 y/o T1R2. Este tipo de expresión del receptor sería similar al procesamiento dependiente de RAMP del receptor relacionado con la calcitonina.Los compuestos identificados con ensayos T1R se pueden utilizar para modular el sabor de alimentos y bebidas. Los ensayos adecuados descritos con más detalle más adelante incluyen, a modo de ejemplo, ensayos de células completas y ensayos bioquímicos que incluyen ensayos de unión directa usando una combinación de diferentes receptores T1R, quimeras o fragmentos de los mismos, especialmente fragmentos que contienen dominios de unión a ligando N-terminal. Los ejemplos de ensayos apropiados para su uso en la invención se describen con mayor detalle a continuación y son conocidos en el campo de GPCR.Pueden diseñarse ensayos que cuantifiquen la unión de diferentes compuestos o mezclas de compuestos a los receptores gustativos T1R o combinaciones de receptores gustativos T1R o receptores T1R expresados en combinación con otras proteínas heterólogas (no T1R), por ejemplo, otros GPCR, o que cuantifiquen la activación de células que expresan receptores gustativos T1R. Esto puede efectuarse mediante la expresión estable o transitoria de receptores gustativos en células heterólogas tales como células HEK-293, CHO y COS.Los ensayos utilizarán preferiblemente células que también expresen (preferiblemente de manera estable) una proteína G tal como Gα
15 o Gα
16 u otras proteínas G promiscuas o variantes de proteínas G, o una proteína G endógena. Además, las proteínas G
β y G
γtambién pueden expresarse allí.El efecto de un compuesto sobre el sabor dulce o umami usando células o composiciones que expresan o contienen los receptores o combinaciones de receptores identificados anteriormente puede determinarse por varios medios, incluido el uso de tintes sensibles al calcio, tintes sensibles al voltaje, ensayos de AMPc, ensayos directos ensayos de unión utilizando ligandos marcados con fluorescencia o ligandos radiactivos como
3H -glutamato, o ensayos transcripcionales (utilizando un indicador adecuado como luciferasa o beta-lactamasa).Los ensayos que se pueden utilizar con uno o más T1R según la invención incluyen, a modo de ejemplo, ensayos que utilizan una selección genética para células vivas; ensayos que utilizan células enteras o fragmentos de membrana o proteínas T1R purificadas; ensayos que utilizan segundos mensajeros como cAMP e IP3, ensayos que detectan la translocación de arrestina a la superficie celular, ensayos que detectan la pérdida de la expresión del receptor en la superficie celular (internalización) mediante ligandos probados, ensayos de unión directa a ligandos, ensayos competitivos ensayos de unión con inhibidores, ensayos que utilizan proteína traducida in vitro, ensayos que detectan cambios conformacionales tras la unión de un ligando (p. ej., como se evidencia mediante proteólisis, fluorescencia o RMN), ensayos de comportamiento que utilizan animales transgénicos no humanos que expresan un T1R o combinación T1R, como moscas, gusanos,También están dentro del alcance de la invención los análisis basados en la estructura en los que se determina la estructura cristalina de rayos X de un fragmento T1R o T1R (o una combinación de T1R, o una combinación de un T1R con otra proteína) y se utiliza para predecir mediante modelado molecular técnicas de compuestos que se unirán y/o mejorarán, imitarán, bloquearán o modularán el receptor T1R particular o la combinación de receptores. Más particularmente, la invención abarca la determinación de la estructura cristalina de T1R1/T1R3 (preferiblemente hT1R1/hT1R3) y/o T1R2/T1R3 (preferiblemente hT1R2/hT1R3) y el uso de tales estructuras cristalinas en métodos de diseño basados en estructuras para identificar moléculas. que modulan la actividad del receptor T1R.La invención incluye especialmente ensayos bioquímicos realizados usando células, por ejemplo, mamífero, levadura, insecto u otras células heterólogas que expresan uno o más receptores T1R de longitud completa o fragmentos, preferiblemente dominios N-terminales de T1R1, T1R2 y/o T1R3. El efecto de un compuesto en dichos ensayos puede determinarse usando ensayos de unión competitiva, por ejemplo, usando glutamato radiactivo o IMP, fluorescencia (por ejemplo, polarización de fluorescencia, FRET), o ensayos de unión de GTPγ
35 S. Como se señaló, en una realización preferida, dichos ensayos utilizarán líneas celulares que coexpresan de forma estable T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3 y una proteína G adecuada como G
α15. Otras proteínas G apropiadas incluyen las proteínas G quiméricas y variantes descritas en la solicitud de EE.UU. Nº 09/984.292, ahora patente de EE.UU. Nº 6.818.747 y 60/243.770, incorporadas por referencia en su totalidad en este documento.Aún más, se pueden construir y expresar receptores alterados que tengan propiedades mejoradas, por ejemplo, expresión de superficie mejorada o acoplamiento de proteína G. Estas variantes de T1R se pueden incorporar en ensayos bioquímicos y basados en células.Se prevé que los descubrimientos actuales relacionados con los T1R humanos se extiendan a otras especies, por ejemplo, roedores, cerdos, monos, perros y gatos, y quizás incluso a animales no mamíferos como los peces. A este respecto, varios fragmentos de T1R de peces se identifican más adelante en el Ejemplo 1. Por lo tanto, la presente invención tiene aplicación en la selección de compuestos para su uso en formulaciones de alimentos para animales.La invención incluye además que utilizan diferentes variantes alélicas de varios T1R y combinaciones de los mismos, permitiendo así la identificación de compuestos que provocan una sensación gustativa específica en individuos que expresan esas variantes alélicas o compuestos que provocan sensaciones gustativas específicas en todos los individuos. Dichos compuestos se pueden usar para hacer que los alimentos sean más agradables al paladar en general.Los ácidos nucleicos que codifican T1R también proporcionan sondas valiosas para la identificación de las células gustativas, ya que los ácidos nucleicos se expresan específicamente en las células gustativas. Por ejemplo, pueden usarse sondas para polipéptidos y proteínas T1R para identificar células gustativas presentes en papilas foliadas, circunvaladas y fungiformes, así como células gustativas presentes en el geschmackstreifen, cavidad oral, epitelio gastrointestinal y epiglotis. En particular, pueden usarse métodos de detección de T1R para identificar células gustativas sensibles a estímulos gustativos dulces y/o umami u otros estímulos gustativos que representen otras modalidades gustativas. Por ejemplo, a partir del trabajo de este documento se podría predecir que las células que expresan T1R2 y/o T1R3 de forma estable o transitoria responderán a los estímulos de sabor dulce. Similarmente, se podría predecir que las células que expresan T1R1 y/o T1R3 responderían a los estímulos gustativos umami. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y polipéptidos T1R de la invención pueden aislarse de una variedad de fuentes, manipularse genéticamente, amplificarse, sintetizarse y/o expresarse recombinantemente de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/035374, que se incorpora aquí como referencia. en su totalidad. En los Ejemplos se proporciona una lista de T1R que pueden expresarse según la invención. Sin embargo, se debe enfatizar que la invención abarca la expresión y el uso de otros T1R específicos o fragmentos, variantes o quimeras construidas en base a tales secuencias de T1R, y particularmente T1R de otras especies. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y polipéptidos T1R de la invención pueden aislarse de una variedad de fuentes, manipularse genéticamente, amplificarse, sintetizarse y/o expresarse recombinantemente de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/035374, que se incorpora aquí como referencia. en su totalidad. En los Ejemplos se proporciona una lista de T1R que pueden expresarse según la invención. Sin embargo, se debe enfatizar que la invención abarca la expresión y el uso de otros T1R específicos o fragmentos, variantes o quimeras construidas en base a tales secuencias de T1R, y particularmente T1R de otras especies. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y polipéptidos T1R de la invención pueden aislarse de una variedad de fuentes, manipularse genéticamente, amplificarse, sintetizarse y/o expresarse recombinantemente de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/035374, que se incorpora aquí como referencia. en su totalidad. En los Ejemplos se proporciona una lista de T1R que pueden expresarse según la invención. Sin embargo, se debe enfatizar que la invención abarca la expresión y el uso de otros T1R específicos o fragmentos, variantes o quimeras construidas en base a tales secuencias de T1R, y particularmente T1R de otras especies. En los Ejemplos se proporciona una lista de T1R que pueden expresarse según la invención. Sin embargo, se debe enfatizar que la invención abarca la expresión y el uso de otros T1R específicos o fragmentos, variantes o quimeras construidas en base a tales secuencias de T1R, y particularmente T1R de otras especies. En los Ejemplos se proporciona una lista de T1R que pueden expresarse según la invención. Sin embargo, se debe enfatizar que la invención abarca la expresión y el uso de otros T1R específicos o fragmentos, variantes o quimeras construidas en base a tales secuencias de T1R, y particularmente T1R de otras especies.Como se describe, un aspecto importante de la invención es la pluralidad de métodos de detección de moduladores, por ejemplo, activadores, inhibidores, estimuladores, potenciadores, agonistas y antagonistas, de estos GPCR específicos de células gustativas. Dichos moduladores de la transducción del gusto son útiles para la modulación de las vías de señalización del gusto. Estos métodos de selección pueden usarse para identificar agonistas y antagonistas de alta afinidad de la actividad de las células gustativas. Estos compuestos moduladores se pueden usar luego en la industria alimentaria para personalizar el sabor, por ejemplo, para modular los sabores dulces y/o umami de los alimentos.Esta invención rectifica la anterior falta de comprensión en relación con el sabor dulce y umami, ya que identifica combinaciones específicas de T1R y receptores T1R que median la sensación de sabor dulce y umami. Por lo tanto, en general, esta solicitud se relaciona con los descubrimientos de los inventores relacionados con la clase T1R de receptores acoplados a proteína G específicos del gusto y su función específica en la percepción del gusto y la relación de estos descubrimientos con una mejor comprensión de la base molecular de gusto.La base molecular del sabor dulce y el sabor umami, el sabor del glutamato monosódico, es enigmática. Recientemente, se identificó una clase de tres miembros de receptores acoplados a proteína G específicos del gusto, denominados T1R. La superposición de patrones de expresión de T1R y la demostración de que el GABA
B estructuralmente relacionadoreceptor es heterodimérico sugieren que los T1R funcionan como receptores gustativos heterodiméricos. En los ejemplos siguientes, los presentes inventores describen la coexpresión funcional de T1R1, T1R2 y T1R3 humanos en células heterólogas; las células que coexpresan T1R1 y T1R3 se activan mediante estímulos gustativos umami; las células que coexpresan T1R2 y T1R3 son activadas por estímulos de sabor dulce. La actividad de T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 se correlacionó con los umbrales de detección psicofísica. Además, se descubrió que el 5′-ribonucleótido IMP mejora la respuesta de T1R1/T1R3 al glutamato, un sinergismo característico del sabor umami. Estos hallazgos demuestran que los T1R específicos y combinaciones particularmente diferentes de los T1R funcionan como receptores de sabor dulce y umami.Se cree que la percepción humana de amargo, dulce y umami está mediada por receptores acoplados a proteína G (Lindemann, B.,
Physiol. Res . 76:718-66 (1996)). Recientemente, la evaluación del genoma humano reveló la clase T2R de receptores de sabor amargo (Adler et al.,
Cell 100:613-702 (2000); Chandrasgekar et al.,
Cell 100:703-11 (2000); Matsunami et al. ,
Naturaleza404: 601-604 (2000)), pero no se han identificado los receptores para el sabor dulce y umami. Recientemente, se identificó otra clase de candidatos a receptores del gusto, los T1R. Los T1R se identificaron primero mediante la secuenciación a gran escala de una biblioteca de cDNA sustraída derivada del tejido gustativo de rata, que identificó T1R1, y posteriormente mediante PCR degenerada basada en T1R1, que condujo a la identificación de T1R2 (Hoon et al.,
Cell 96: 541-551 (1999)). Recientemente, los presentes inventores y otros identificaron un tercer y posiblemente último miembro de la familia T1R, T1R3, en el banco de datos del genoma humano (Kitagawa et al.,
Biochem Biophys. Res Commun . 283(1): 236-42 (2001); Max y col.,
Nat. Genet . 28(1): 58-63 (2001), Sainz y col.,
J. Neurochem. 77(3): 896-903 (2001); Montmayeur y col.,
Nat. Neurociencias _ 4, 492-8. (2001)). De manera reveladora, el ratón T1R3 se asigna a un intervalo genómico que contiene Sac, un locus que influye en el sabor dulce del ratón (Fuller et al.,
J. Hered . 65:33-6 (1974); Li et al.,
Mamm. Genome 12: 13-16 (2001)). Por lo tanto, se predijo que T1R3 funcionaría como un receptor de sabor dulce. Recientes estudios de mapeo genético de alta resolución han fortalecido la conexión entre el ratón T1R3 y Sac (Fuller TC,
J. Hered . 65(1): 33-36 (1974); Li et al.,
Mammal. Genome 12(1):13 -16 (2001)).Curiosamente, todos los receptores de la familia C que se han expresado funcionalmente hasta el momento: receptores metabotrópicos de glutamato, el receptor GABA
B , el receptor sensible al calcio (Conigrave, AD, Quinn, SJ & Brown, EM,
Proc Natl Acad Sci USA 97, 4814 -9. (2000)), y un receptor olfativo de pescado (Speca, DJ et al.,
Neuron23, 487-98. (1999))—se ha demostrado que son activados por aminoácidos. Esta característica común plantea la posibilidad de que los T1R reconozcan aminoácidos y que los T1R puedan estar involucrados en la detección de glutamato además de los aminoácidos de sabor dulce. Alternativamente, se ha propuesto que una variante transcripcional del receptor de glutamato metabotrópico mGluR4 es el receptor del gusto umami debido a su expresión selectiva en el tejido del gusto de la rata y la similitud del umbral de activación del receptor con el umbral de detección psicofísica del glutamato (Chaudhari et al. ,
Nat. Neurosci. 3:113-119 (2000)). Esta hipótesis es difícil de conciliar con el nivel de expresión extremadamente bajo de la variante mGluR4 en el tejido gustativo y el sabor a glutamato más o menos inalterado de los ratones knockout para mGluR4 (Chaudhari y Roper,
Ann. NY Acad. Sci . 855:398-406 ( 1998)). Además, la variante de sabor es estructuralmente inverosímil, ya que carece no solo de la mayoría de los residuos que forman el bolsillo de unión de glutamato del receptor de tipo salvaje, sino también de aproximadamente la mitad del dominio de unión de glutamato N-terminal globular (Kunishima et al. ,
Nature407:971-7 (2000)).El análisis comparativo de los patrones de expresión de T1R en roedores ha demostrado que T1R2 y posiblemente T1R1 se coexpresan cada uno con T1R3 (Hoon et al.,
Cell 96:541-51 (1999); Kitagawa et al.,
Biochem Biophy. Res. Commun . 283: 236-242 (2001), Max y col.,
Nat. Genet . 28:58-63 (2001), Montmayeur y col.,
Nat. Neurosci 4:492-8 (2001), Sainz y col., J. Neurochem 77:896-903 (2001)). Además, la dimerización está emergiendo como un tema común de los receptores de la familia C: el glutamato metabotrópico y el receptor sensible al calcio son homodímeros (Romomano et al.,
J. Biol. Chem . 271:28612-6 (1996); Okamoto et al. ,
J. Biol. Química. 273: 13089-96 (1998); Han y col.,
J. Biol. quimica _ 274:100008-13 (1999); Bai y col.,
J. Biol. quimica _ 273:23605-10 (1998)), y el receptor GABA
B estructuralmente relacionado es heterodimérico (Jones et al.,
Nature 396:674-9 (1998); Kaupmann et al.,
Nature 396:683-687 (1998); White y col.,
Nature 396: 679-682 (1998), Kuner y col.,
Science283:74-77 (1999)). Los presentes inventores han demostrado mediante la coexpresión funcional de T1R en células heterólogas que T1R2 humano funciona en combinación con T1R3 humano como receptor de sabor dulce y que T1R1 humano funciona en combinación con T1R3 humano como receptor de sabor umami.Los descubrimientos discutidos aquí son especialmente significativos, ya que anteriormente el desarrollo de edulcorantes artificiales mejorados se ha visto obstaculizado por la falta de ensayos para el sabor dulce. De hecho, los cinco edulcorantes artificiales comerciales de uso común, todos los cuales activan hT1R2/hT1R3, se descubrieron por casualidad. Del mismo modo, aparte de las pruebas sensoriales, un proceso laborioso, no existe un ensayo para identificar los compuestos que modulan el sabor umami. Estos problemas ahora se alivian porque, según lo establecido por los resultados experimentales discutidos más adelante, se han identificado los receptores umami y dulces humanos, y se han desarrollado ensayos para estos receptores, particularmente ensayos que usan células que expresan de manera estable un receptor de sabor T1R funcional, es decir, el receptor del gusto dulce o umami.Basándose en ello, la invención proporciona ensayos para detectar y caracterizar compuestos moduladores del sabor, en los que los miembros de la familia T1R actúan, como lo hacen en la papila gustativa, como moléculas indicadoras del efecto sobre el sabor dulce y umami de los compuestos moduladores del sabor. Particularmente proporcionados y dentro del alcance de la invención están los ensayos para identificar compuestos que modulan, imitan, mejoran y/o bloquean individualmente los sabores dulce y umami. Los métodos para ensayar la actividad de los GPCR, y especialmente los compuestos que afectan la actividad de los GPCR, son bien conocidos y son aplicables al miembro de la familia T1R de la presente invención y combinaciones funcionales de los mismos. Se han identificado ensayos adecuados supra.En particular, los GPCR en cuestión pueden usarse en ensayos para, por ejemplo, medir cambios en la unión de ligandos, concentración de iones, potencial de membrana, flujo de corriente, flujo de iones, transcripción, interacciones receptor-ligando, concentraciones de segundos mensajeros, in vitro e in vivo. En otra realización, los miembros de la familia T1R pueden expresarse recombinantemente en células, y la modulación de la transducción gustativa a través de la actividad de GPCR puede analizarse midiendo los cambios en los niveles de Ca
2+ y otros mensajes intracelulares como AMPc, GMPc o IP
3 .En determinados ensayos, un dominio de un polipéptido T1R, por ejemplo, un dominio extracelular, transmembrana o intracelular, se fusiona con un polipéptido heterólogo, formando así un polipéptido quimérico, por ejemplo, una proteína quimérica con actividad GPCR. Se contempla particularmente el uso de fragmentos de T1R1, T1R2 o T1R3 que contienen el dominio de unión al ligando N-terminal. Estas proteínas son útiles, por ejemplo, en ensayos para identificar ligandos, agonistas, antagonistas u otros moduladores de los receptores T1R. Por ejemplo, un polipéptido T1R puede expresarse en una célula eucariota como un receptor quimérico con una secuencia de chaperona heteróloga que facilita el tráfico de la membrana plasmática, o la maduración y el direccionamiento a través de la vía secretora. La secuencia heteróloga opcional puede ser un péptido que interactúa con el dominio PDZ, tal como un fragmento PDZIP C-terminal (SEQ ID NO 1). POZIP es una señal de exportación de ER que, según la presente invención, se ha demostrado que facilita la expresión superficial de proteínas heterólogas como los receptores T1R descritos en el presente documento. Más particularmente, en un aspecto de la invención, PDZIP se puede usar para promover el direccionamiento adecuado de proteínas de membrana problemáticas, como los receptores olfativos, los receptores del gusto T2R y los receptores del gusto T1R descritos en el presente documento.Dichos receptores T1R quiméricos pueden expresarse en cualquier célula eucariota, como las células HEK-293. Preferiblemente, las células contienen una proteína G, preferiblemente una proteína G promiscua como G
α15 o G
α16u otro tipo de proteína G promiscua capaz de vincular una amplia gama de GPCR a una vía de señalización intracelular o a una proteína de señalización como la fosfolipasa C. La activación de dichos receptores quiméricos en dichas células se puede detectar utilizando cualquier método estándar, como por ejemplo detectando cambios en el calcio intracelular mediante la detección de fluorescencia dependiente de FURA-2 en la célula. Si las células huésped preferidas no expresan una proteína G apropiada, pueden transfectarse con un gen que codifica una proteína G promiscua como las descritas en la solicitud de EE.UU. Nº 60/243.770, solicitud de EE.UU. Nº 09/984.297, presentada el 29 de octubre de 2001, y la solicitud de EE.UU. Nº 09/989.497 presentada el 21 de noviembre de 2001 que se incorporan aquí como referencia en su totalidad.Los métodos adicionales de ensayo de moduladores de la transducción del gusto incluyen ensayos de unión de ligandos in vitro usando: polipéptidos T1R, porciones de los mismos, es decir, el dominio extracelular, región transmembrana o combinaciones de los mismos, o proteínas quiméricas que comprenden uno o más dominios de un miembro de la familia T1R ; ovocitos o células de cultivo tisular que expresan polipéptidos T1R, fragmentos o proteínas de fusión; fosforilación y desfosforilación de miembros de la familia T1R; unión de proteína G a GPCR; ensayos de unión a ligandos; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; ensayos de flujo de iones; cambios en los segundos mensajeros intracelulares como cGMP, cAMP y trifosfato de inositol (IP3); y cambios en los niveles de calcio intracelular.Además, la invención proporciona métodos para detectar la expresión de proteínas y ácidos nucleicos de T1R, lo que permite la investigación de la regulación de la transducción del gusto y la identificación específica de células receptoras del gusto. Los miembros de la familia T1R también proporcionan sondas de ácido nucleico útiles para investigaciones forenses y de paternidad. Los genes T1R también son útiles como sondas de ácido nucleico para identificar células receptoras del gusto, tales como células receptoras del gusto foliadas, fungiformes, circunvaladas, geschmackstreifen y epiglotis. Los receptores T1R también se pueden usar para generar anticuerpos monoclonales y policlonales útiles para identificar células receptoras del gusto.Funcionalmente, los polipéptidos T1R comprenden una familia de siete receptores acoplados a proteína G transmembrana relacionados, que se cree que están involucrados en la transducción del gusto y pueden interactuar con una proteína G para mediar en la transducción de la señal del gusto (ver, por ejemplo, Fong,
Cell Signal , 8 :217 (1996); Baldwin,
Cur. Opin. Cell Biol., 6:180 (1994)). Estructuralmente, las secuencias de nucleótidos de los miembros de la familia T1R codifican polipéptidos relacionados que comprenden un dominio extracelular, siete dominios transmembrana y un dominio citoplasmático. Los genes de la familia T1R relacionados de otras especies comparten al menos aproximadamente el 50 % y, opcionalmente, el 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, identidad de secuencia de nucleótidos en una región de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, opcionalmente 100, 200, 500 , o más nucleótidos de longitud que las secuencias de ácido nucleico de T1R descritas en el presente documento en los Ejemplos, o variantes de las mismas modificadas de forma conservadora, o codifican polipéptidos que comparten al menos aproximadamente 35 a 50 %, y opcionalmente 60 %, 70 %, 80 % o 90 % , identidad de secuencia de aminoácidos en una región de aminoácidos de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud,También se han identificado varias secuencias o dominios de aminoácidos de consenso que son característicos de los miembros de la familia T1R. Por ejemplo, los miembros de la familia T1R típicamente comprenden una secuencia que tiene al menos aproximadamente 50 %, opcionalmente 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95-99 % o más, identidad con las secuencias consenso 1 y 2 de T1R (SEQ ID NO. 2 y 3, respectivamente). Estos dominios conservados, por lo tanto, pueden usarse para identificar miembros de la familia T1R, por identidad, hibridación específica o amplificación, o unión específica por anticuerpos producidos contra un dominio. Las secuencias consenso de T1R incluyen a modo de ejemplo las siguientes secuencias:Secuencia de consenso familiar T1R 1: (SEQ ID NO: 2)(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)ET1R Family Consensus Sequence 2: (SEQ ID NO: 3)(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)Estas secuencias consenso incluyen las que se encuentran en los polipéptidos T1R descritos aquí, pero se puede esperar que los miembros de la familia T1R de otros organismos comprendan secuencias consenso que tienen aproximadamente un 75% de identidad o más con las secuencias consenso inclusivas descritas específicamente aquí.Se pueden usar regiones específicas de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de T1R para identificar variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de miembros de la familia T1R. Esta identificación se puede realizar in vitro, por ejemplo, en condiciones de hibridación estrictas o PCR (por ejemplo, usando cebadores que codifican las secuencias consenso de T1R identificadas anteriormente), o usando la información de la secuencia en un sistema informático para comparar con otras secuencias de nucleótidos. Los diferentes alelos de los genes T1R dentro de una población de una sola especie también serán útiles para determinar si las diferencias en las secuencias alélicas controlan las diferencias en la percepción del gusto entre los miembros de la población. Las técnicas clásicas de amplificación y clonación de tipo PCR son útiles para aislar nuevos T1R, por ejemplo, cuando los cebadores degenerados son suficientes para detectar genes relacionados entre especies.Normalmente, la identificación de variantes polimórficas y alelos de miembros de la familia T1R se puede realizar comparando una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 25 aminoácidos o más, por ejemplo, 50-100 aminoácidos. La identidad de aminoácidos de aproximadamente al menos 35 a 50 % y, opcionalmente, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95-99 % o superior demuestra típicamente que una proteína es una variante polimórfica, interespecies homólogo o alelo de un miembro de la familia T1R. La comparación de secuencias se puede realizar usando cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias que se analizan a continuación. Los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos T1R o una región conservada de los mismos también se pueden usar para identificar alelos, homólogos entre especies y variantes polimórficas.
Las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos de los genes T1R se pueden confirmar mediante el examen de la expresión específica de células gustativas del gen o la proteína T1R putativos. Típicamente, los polipéptidos T1R que tienen una secuencia de aminoácidos descrita en este documento se pueden usar como un control positivo en comparación con el polipéptido T1R putativo para demostrar la identificación de una variante polimórfica o alelo del miembro de la familia T1R. Se espera que las variantes polimórficas, los alelos y los homólogos entre especies conserven la estructura transmembrana de siete de un receptor acoplado a proteína G. Para obtener más detalles, véase el documento WO 00/06592, que describe miembros de la familia T1R relacionados, GPCR-B3, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia de manera coherente con esta descripción. Los receptores GPCR-B3 se denominan aquí rT1R1 y mT1R1. Además, véase el documento WO 00/06593, que también describe miembros de la familia T1R relacionados, GPCR-B4, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia de manera coherente con esta descripción. Los receptores GPCR-B4 se denominan aquí rT1R2 y mT1R2. Como se discutió anteriormente, la invención también incluye ensayos basados en la estructura que utilizan la estructura cristalina de rayos X de una combinación de T1R o T1R, por ejemplo, hT1R2/hT1R3 o hT1R1/hT1R3, para identificar moléculas que modulan la actividad del receptor T1R y, por lo tanto, modulan el sabor dulce. y/o sabor umami.La presente invención también proporciona ensayos, preferiblemente ensayos de alto rendimiento, para identificar moléculas que potencian, imitan, bloquean y/o modulan los receptores T1R. En algunos ensayos, un dominio particular de un miembro de la familia T1R se usa en combinación con un dominio particular de otro miembro de la familia T1R, por ejemplo, un dominio o región extracelular, transmembrana o intracelular. En otras realizaciones, un dominio extracelular, una región transmembrana o una combinación de los mismos puede unirse a un sustrato sólido y usarse, por ejemplo, para aislar ligandos, agonistas, antagonistas o cualquier otra molécula que pueda unirse y/o modular la actividad de un polipéptido T1R.Se prevé que varias mutaciones y sustituciones conservadoras estén dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, está dentro del nivel de experiencia en la técnica realizar sustituciones de aminoácidos utilizando protocolos conocidos de tecnología de genes recombinantes que incluyen PCR, clonación de genes, mutagénesis dirigida al sitio de cDNA, transfección de células huésped y transcripción in vitro. Las variantes podrían luego ser examinadas para detectar actividad.DefinicionesTal como se usan en este documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.Las «células gustativas» incluyen células neuroepiteliales que se organizan en grupos para formar las papilas gustativas de la lengua, por ejemplo, células foliadas, fungiformes y circunvaladas (véase, por ejemplo, Roper et al.,
Ann. Rev. Neurosci . 12:329-353). (1989)). Las células gustativas también se encuentran en el paladar y otros tejidos, como el esófago y el estómago.»T1R» se refiere a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados a proteína G que se expresan en las células del gusto, como las células foliares, fungiformes y circunvaladas, así como en las células del paladar y el esófago (ver, por ejemplo, Hoon et al.,
Célula, 96: 541 – 551 (1999), incorporado aquí como referencia en su totalidad). Los miembros de esta familia también se denominan GPCR-B3 y TR1 en el documento WO 00/06592, así como GPCR-B4 y TR2 en el documento WO 00/06593. GPCR-B3 también se denomina aquí rT1R1, y GPCR-B4 se denomina rT1R2. Las células receptoras del gusto también pueden identificarse sobre la base de la morfología (véase, por ejemplo, Roper, supra), o mediante la expresión de proteínas expresadas específicamente en las células del gusto. Los miembros de la familia T1R pueden tener la capacidad de actuar como receptores para la transducción del sabor dulce o para distinguir entre varias otras modalidades gustativas. Las secuencias de T1R representativas, que incluyen hT1R1, hT1R2 y hT1R3, se identifican más adelante en los ejemplos.Los ácidos nucleicos «T1R» codifican una familia de GPCR con siete regiones transmembrana que tienen «actividad de receptor acoplado a proteína G», por ejemplo, pueden unirse a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promover la producción de segundos mensajeros como IP3, cAMP, cGMP y Ca
2+ a través de la estimulación de enzimas tales como fosfolipasa C y adenilato ciclasa (para una descripción de la estructura y función de los GPCR, véase, por ejemplo, Fong, supra, y Baldwin, supra). Una sola célula gustativa puede contener muchos polipéptidos T1R distintos.Por lo tanto, el término familia «T1R» se refiere a variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos entre especies que: (1) tienen al menos alrededor de 35 a 50% de identidad de secuencia de aminoácidos, opcionalmente alrededor de 60, 75, 80, 85, 90, 95 , 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido T1R, preferiblemente los identificados en el Ejemplo 1, en una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente 50-100 aminoácidos; (2) unirse específicamente a anticuerpos generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en la secuencia polipeptídica T1R descrita en el Ejemplo 1 y variantes de la misma modificadas de forma conservadora; (3) están codificadas por una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente (con un tamaño de al menos alrededor de 100, opcionalmente al menos aproximadamente 500-1000 nucleótidos) en condiciones de hibridación estrictas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de ácido nucleico de T1R contenidas en el Ejemplo 1, y variantes de las mismas modificadas de forma conservadora; o (4) comprenden una secuencia idéntica en al menos aproximadamente un 35 a un 50 % a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de T1R identificada en el Ejemplo 1.Topológicamente, ciertos GPCR quimiosensoriales tienen un «dominio N-terminal»; “dominios extracelulares”; «dominios transmembrana» que comprenden siete regiones transmembrana y bucles citoplásmicos y extracelulares correspondientes; «dominios citoplasmáticos» y un «dominio C-terminal» (véase, por ejemplo, Hoon et al.,
Cell , 96:541-551 (1999); Buck & Axel,
Cell , 65:175-187 (1991)). Estos dominios pueden identificarse estructuralmente utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia, como programas de análisis de secuencias que identifican dominios hidrofóbicos e hidrofílicos (ver, por ejemplo, Stryer,
Biochemistry, (3ª ed. 1988); consulte también cualquiera de una serie de programas de análisis de secuencias basados en Internet, como los que se encuentran en dot.imgen.bcm.tmc.edu). Dichos dominios son útiles para producir proteínas quiméricas y para ensayos in vitro de la invención, por ejemplo, ensayos de unión de ligandos.Por lo tanto, «dominios extracelulares» se refiere a los dominios de los polipéptidos T1R que sobresalen de la membrana celular y están expuestos a la cara extracelular de la célula. Dichos dominios generalmente incluyen el «dominio N terminal» que está expuesto a la cara extracelular de la célula y, opcionalmente, pueden incluir porciones de los bucles extracelulares del dominio transmembrana que están expuestos a la cara extracelular de la célula, es decir, los bucles entre regiones transmembrana 2 y 3, entre las regiones transmembrana 4 y 5, y entre las regiones transmembrana 6 y 7.La región del «dominio N-terminal» comienza en el extremo N-terminal y se extiende hasta una región cercana al inicio del primer dominio transmembrana. Más particularmente, en una realización de la invención, este dominio comienza en el extremo N-terminal y termina aproximadamente en el ácido glutámico conservado en la posición de aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. Estos dominios extracelulares son útiles para ensayos de unión de ligandos in vitro, tanto en fase soluble como sólida. Además, las regiones transmembrana, descritas a continuación, también pueden unirse a ligandos en combinación con el dominio extracelular y, por lo tanto, también son útiles para ensayos de unión de ligandos in vitro.El «dominio transmembrana», que comprende las siete «regiones transmembrana», se refiere al dominio de los polipéptidos T1R que se encuentra dentro de la membrana plasmática y también puede incluir los bucles citoplásmicos (intracelulares) y extracelulares correspondientes. En una realización, esta región corresponde al dominio de los miembros de la familia T1R que comienza aproximadamente en el residuo de ácido glutámico conservado en la posición de aminoácido 563 más o menos 20 aminoácidos y termina aproximadamente en el residuo de aminoácido de tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos. Las siete regiones transmembrana y los bucles extracelulares y citoplásmicos pueden identificarse usando métodos estándar, como se describe en Kyte & Doolittle,
J. Mol. Biol ., 157:105-32 (1982)), o en Stryer, supra.Los «dominios citoplasmáticos» se refieren a los dominios de los polipéptidos T1R que miran hacia el interior de la célula, por ejemplo, el «dominio C-terminal» y los bucles intracelulares del dominio transmembrana, por ejemplo, el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 1 y 2, el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 3 y 4, y el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 5 y 6. «Dominio C-terminal» se refiere a la región que se extiende al final del último dominio transmembrana y el extremo C-terminal de la proteína, y que normalmente se encuentra dentro del citoplasma. En una realización, esta región comienza en el residuo de aminoácido de tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos y continúa hasta el extremo C-terminal del polipéptido.El término «región de unión a ligando» o «dominio de unión a ligando» se refiere a secuencias derivadas de un receptor gustativo, particularmente un receptor gustativo que incorpora sustancialmente al menos el dominio extracelular del receptor. En una realización, el dominio extracelular de la región de unión al ligando puede incluir el dominio N-terminal y, opcionalmente, porciones del dominio transmembrana, como los bucles extracelulares del dominio transmembrana. La región de unión al ligando puede ser capaz de unirse a un ligando y, más particularmente, a un compuesto que mejora, imita, bloquea y/o modula el sabor, por ejemplo, el sabor dulce o umami.La frase «heteromultímero» o «complejo heteromultimérico» en el contexto de los receptores T1R o polipéptidos de la invención se refiere a una asociación funcional de al menos un receptor T1R y otro receptor, típicamente otro polipéptido receptor T1R (o, alternativamente, otro receptor no T1R). polipéptido receptor). Para mayor claridad, la codependencia funcional de los T1R se describe en esta solicitud como reflejo de su posible función como complejos heterodiméricos de receptores gustativos. Sin embargo, como se discutió anteriormente, la codependencia funcional puede reflejar alternativamente una interacción indirecta. Por ejemplo, T1R3 puede funcionar únicamente para facilitar la expresión superficial de T1R1 y T1R2, que pueden actuar de forma independiente como receptores del gusto. Alternativamente, un receptor del gusto funcional puede estar compuesto únicamente por T1R3,La frase «efectos funcionales» en el contexto de ensayos para probar compuestos que modulan la transducción gustativa mediada por miembros de la familia T1R incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirecta o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Incluye unión de ligandos, cambios en el flujo de iones, potencial de membrana, flujo de corriente, transcripción, unión a proteínas G, fosforilación o desfosforilación de GPCR, ensayos basados en cambios de conformación, transducción de señales, interacciones receptor-ligando, concentraciones de segundos mensajeros (p. ej., CAMP, cGMP , IP3 o Ca
2+ intracelular ), in vitro, in vivo y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como aumentos o disminuciones de la liberación de neurotransmisores u hormonas.Por «determinar el efecto funcional» en el contexto de los ensayos se entiende ensayos para un compuesto que aumenta o disminuye un parámetro que está directa o indirectamente bajo la influencia de un miembro de la familia T1R, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Dichos efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbencia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o de solubilidad, fijación de parche, colorantes sensibles al voltaje, corrientes de células enteras, salida de radioisótopos, marcadores inducibles, ovocitos. expresión del gen T1R; expresión de T1R en células de cultivo tisular; activación transcripcional de genes T1R; ensayos de unión a ligandos; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; ensayos de flujo de iones; cambios en los segundos mensajeros intracelulares como CAMP, cGMP y trifosfato de inositol (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisores, ensayos conformacionales y similares.Los «inhibidores», «activadores» y «moduladores» de genes o proteínas T1R se utilizan para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas mediante ensayos in vitro e in vivo para la transducción del gusto, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos.Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente la estimulación, disminuyen, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan a la baja la transducción gustativa, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o regulan al alza la transducción gustativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (por ejemplo, ebnerina y otros miembros de la familia de transportadores hidrofóbicos); proteínas G; quinasas (p. ej., homólogos de rodopsina quinasa y quinasas de receptor beta adrenérgico que están involucradas en la desactivación y desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan los receptores. Los moduladores pueden incluir versiones modificadas genéticamente de miembros de la familia T1R, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y similares que se producen de forma natural y sintética. Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la expresión de miembros de la familia T1R en células o membranas celulares, la aplicación de supuestos compuestos moduladores, en presencia o ausencia de saborizantes, por ejemplo, saborizantes dulces, y luego la determinación de los efectos funcionales sobre la transducción del gusto, como se describe arriba. Las muestras o ensayos que comprenden miembros de la familia T1R que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de modulación. Muestras de control positivo (p. ej.A las muestras de control negativo (p. ej., tampón sin un estímulo gustativo añadido) se les asigna un valor de actividad T1R relativo del 0%. La inhibición de un T1R se logra cuando una mezcla de la muestra de control positivo y un modulador da como resultado que el valor de actividad de T1R en relación con el control positivo sea de aproximadamente 80 %, opcionalmente 50 % o 25-0 %. La activación de un T1R por un modulador solo se logra cuando el valor de actividad de T1R relativo a la muestra de control positivo es 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, opcionalmente 100 %, opcionalmente 150 %, opcionalmente 200-500 % o 1000 -3000% superior.Los términos «purificado», «sustancialmente purificado» y «aislado» como se usan en el presente documento se refieren al estado de estar libre de otros compuestos diferentes con los que el compuesto de la invención se asocia normalmente en su estado natural, de modo que el «purificado , «sustancialmente purificado» y sujeto «aislado» comprende al menos 0,5%, 1%, 5%, 10% o 20%, y lo más preferiblemente al menos 50% o 75% de la masa, en peso, de un muestra dada. En una realización preferida, estos términos se refieren al compuesto de la invención que comprende al menos el 95% de la masa, en peso, de una muestra dada. Como se usa aquí, los términos «purificado», «sustancialmente purificado» y «aislado», cuando se refieren a un ácido nucleico o proteína, también se refieren a un estado de purificación o concentración diferente al que ocurre naturalmente en el mamífero, especialmente en el cuerpo humano. Cualquier grado de purificación o concentración superior a la que se produce naturalmente en el cuerpo de los mamíferos, especialmente en los humanos, incluida (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no se asocia en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de «aislados». El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en este documento, pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procesos conocidos por los expertos. en el arte incluyendo (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no se asocia en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de «aislados». El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en este documento, pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procesos conocidos por los expertos. en el arte incluyendo (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no se asocia en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de «aislados». El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en este documento, pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procesos conocidos por los expertos. en el arteEl término «ácido nucleico» o «secuencia de ácido nucleico» se refiere a un oligonucleótido desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de cadena simple o doble. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras similares a ácidos nucleicos con esqueletos sintéticos (ver, por ejemplo,
Oligonucleótidos y análogos, un enfoque práctico , ed. F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategies,
Annals of the NY Academy of Sciences , Vol. 600, Eds. Baserga et al. (NYAS 1992), Milligan
J. Med. Chem . 36:1923-1937 (1993),
Investigación y aplicaciones antisentido(1993, CRC Press), WO 97/03211; documento WO 96/39154; Mata,
Toxicol. aplicación Farmacol . 144:189-197 (1997); Strauss-Soukup,
Bioquímica 36:8692-8698 (1997); Samstag,
Antisense Nucleic Acid Drug Dev , 6:153 – 156 (1996)).A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma (p. ej., sustituciones de codones degeneradas) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando, por ejemplo, secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al.,
Nucleic Acid Res ., 19:5081 ). (1991), Ohtsuka y col.,
J. Biol. Chem ., 260:2605-2608 (1985), Rossolini y col.,
Mol. Cell. Probes , 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.Los términos «polipéptido», «péptido» y «proteína» se usan indistintamente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.El término «dominio de translocación de la membrana plasmática» o simplemente «dominio de translocación» se refiere a un dominio polipeptídico que, cuando se incorpora a una secuencia de codificación polipeptídica, puede «acompañar» o «translocar» con mayor eficacia la proteína híbrida («fusión») a la célula. membrana plasmática que sin el dominio. Por ejemplo, un «dominio de translocación» puede derivarse del extremo amino del polipéptido del receptor de rodopsina bovino, un receptor transmembrana 7. Sin embargo, puede usarse rodopsina de cualquier mamífero, al igual que otras secuencias que facilitan la translocación. Por lo tanto, el dominio de translocación es particularmente eficiente en la translocación de proteínas de fusión transmembrana 7 a la membrana plasmática, y una proteína (por ejemplo, un polipéptido del receptor del gusto) que comprende un dominio de translocación amino terminal será transportado a la membrana plasmática más eficientemente que sin el dominio. Sin embargo, si el dominio N-terminal del polipéptido es activo en la unión, como ocurre con los receptores T1R de la presente invención, puede preferirse el uso de otros dominios de translocación. Por ejemplo, puede usarse un péptido que interactúa con el dominio PDZ, como se describe en el presente documento.Las composiciones de «dominio de translocación», «dominio de unión a ligando» y receptores quiméricos descritas en el presente documento también incluyen «análogos» o «variantes conservativas» y «miméticos» («peptidomiméticos») con estructuras y actividad que corresponden sustancialmente a las secuencias ejemplares. . Por lo tanto, los términos «variante conservativa» o «análogo» o «mimético» se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada, de modo que los cambios no alteran sustancialmente la estructura del polipéptido (la variante conservativa) y/o actividad, tal como se define en este documento. Estos incluyen variaciones conservativamente modificadas de una secuencia de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos, adiciones o eliminaciones de aquellos residuos que no son críticos para la actividad de la proteína, o sustitución de aminoácidos con residuos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos,Más particularmente, las «variantes modificadas de forma conservadora» se aplican tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada.Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que un codón especifica una alanina, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado.Tales variaciones de ácido nucleico son «variaciones silenciosas», que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento, que codifica un polipéptido, también describe todas las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido, está implícita en cada secuencia descrita.Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, una directriz ejemplar para seleccionar sustituciones conservativas incluye (residuo original seguido de sustitución ejemplar): ala/gly o ser; arg/lis; asn/gln o suyo; asp/glú; cis/ser; ginebra/asn; gly/áspid; gly/ala o pro; su/asn o ginebra; ile/leu o val; leu/ile o val; lys/arg o gin o glu; metlleu o tyr o ile; phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp o phe; val/ile o leu. Una directriz ejemplar alternativa utiliza los siguientes seis grupos, cada uno de los cuales contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (I); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); (ver también, por ejemplo, Creighton,
Proteínas , WH Freeman and Company (1984); Schultz y Schimer,
Principios de estructura de proteínas , Springer-Vrlag (1979)). Un experto en la técnica apreciará que las sustituciones identificadas anteriormente no son las únicas sustituciones conservadoras posibles. Por ejemplo, para algunos propósitos, uno puede considerar todos los aminoácidos cargados como sustituciones conservativas entre sí, ya sean positivos o negativos. Además, las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada también pueden considerarse «variaciones modificadas de forma conservadora».Los términos «mimético» y «peptidomimético» se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos, por ejemplo, dominios de translocación, dominios de unión a ligandos o receptores quiméricos de la invención. El mimético puede estar completamente compuesto de análogos de aminoácidos sintéticos, no naturales, o puede ser una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales siempre que tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético.Al igual que con los polipéptidos de la invención que son variantes conservativas, la experimentación rutinaria determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, es decir, si su estructura y/o función no se altera sustancialmente. Las composiciones miméticas de polipéptidos pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales, que son típicamente de tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos distintos de los enlaces de enlace amida natural («enlace peptídico»); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos naturales; oc) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, un giro beta, giro gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa, y similares. Un polipéptido se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios químicos distintos de los enlaces peptídicos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales pueden unirse mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). ). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de enlace amida tradicionales («enlace peptídico») incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(═O)-CH N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de enlace amida tradicionales («enlace peptídico») incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(═O)-CH N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de enlace amida tradicionales («enlace peptídico») incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(═O)-CH
2 — para —C(═O)—NH—), aminometileno (CH
2 —NH), etileno, olefina (CH═CH), éter (CH
2 —O), tioéter (CH
2 —S), tetrazol (CN
4 ), tiazol, retroamida, tioamida o éster (ver, por ejemplo, Spatola,
Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins , Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY (1983) )). Un polipéptido también se puede caracterizar como mimético porque contiene todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos naturales; los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patentes.Una «marca» o un «resto detectable» es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen
32 P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (p. ej., como se usan comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en el péptido o se usa para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido.Una «sonda de ácido nucleico u oligonucleótido marcado» es una que está unida, ya sea de forma covalente, a través de un enlazador o un enlace químico, o de forma no covalente, a través de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de tal manera que la presencia del la sonda puede detectarse detectando la presencia del marcador unido a la sonda.
Las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos de los genes T1R se pueden confirmar mediante el examen de la expresión específica de células gustativas del gen o la proteína T1R putativos. Típicamente, los polipéptidos T1R que tienen una secuencia de aminoácidos descrita en este documento se pueden usar como un control positivo en comparación con el polipéptido T1R putativo para demostrar la identificación de una variante polimórfica o alelo del miembro de la familia T1R. Se espera que las variantes polimórficas, los alelos y los homólogos entre especies conserven la estructura transmembrana de siete de un receptor acoplado a proteína G. Para obtener más detalles, véase el documento WO 00/06592, que describe miembros de la familia T1R relacionados, GPCR-B3, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia de manera coherente con esta descripción. Los receptores GPCR-B3 se denominan aquí rT1R1 y mT1R1. Además, véase el documento WO 00/06593, que también describe miembros de la familia T1R relacionados, GPCR-B4, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia de manera coherente con esta descripción. Los receptores GPCR-B4 se denominan aquí rT1R2 y mT1R2. Como se discutió anteriormente, la invención también incluye ensayos basados en la estructura que utilizan la estructura cristalina de rayos X de una combinación de T1R o T1R, por ejemplo, hT1R2/hT1R3 o hT1R1/hT1R3, para identificar moléculas que modulan la actividad del receptor T1R y, por lo tanto, modulan el sabor dulce. y/o sabor umami.La presente invención también proporciona ensayos, preferiblemente ensayos de alto rendimiento, para identificar moléculas que potencian, imitan, bloquean y/o modulan los receptores T1R. En algunos ensayos, un dominio particular de un miembro de la familia T1R se usa en combinación con un dominio particular de otro miembro de la familia T1R, por ejemplo, un dominio o región extracelular, transmembrana o intracelular. En otras realizaciones, un dominio extracelular, una región transmembrana o una combinación de los mismos puede unirse a un sustrato sólido y usarse, por ejemplo, para aislar ligandos, agonistas, antagonistas o cualquier otra molécula que pueda unirse y/o modular la actividad de un polipéptido T1R.Se prevé que varias mutaciones y sustituciones conservadoras estén dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, está dentro del nivel de experiencia en la técnica realizar sustituciones de aminoácidos utilizando protocolos conocidos de tecnología de genes recombinantes que incluyen PCR, clonación de genes, mutagénesis dirigida al sitio de cDNA, transfección de células huésped y transcripción in vitro. Las variantes podrían luego ser examinadas para detectar actividad.DefinicionesTal como se usan en este documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.Las «células gustativas» incluyen células neuroepiteliales que se organizan en grupos para formar las papilas gustativas de la lengua, por ejemplo, células foliadas, fungiformes y circunvaladas (véase, por ejemplo, Roper et al.,
Ann. Rev. Neurosci . 12:329-353). (1989)). Las células gustativas también se encuentran en el paladar y otros tejidos, como el esófago y el estómago.»T1R» se refiere a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados a proteína G que se expresan en las células del gusto, como las células foliares, fungiformes y circunvaladas, así como en las células del paladar y el esófago (ver, por ejemplo, Hoon et al.,
Célula, 96: 541 – 551 (1999), incorporado aquí como referencia en su totalidad). Los miembros de esta familia también se denominan GPCR-B3 y TR1 en el documento WO 00/06592, así como GPCR-B4 y TR2 en el documento WO 00/06593. GPCR-B3 también se denomina aquí rT1R1, y GPCR-B4 se denomina rT1R2. Las células receptoras del gusto también pueden identificarse sobre la base de la morfología (véase, por ejemplo, Roper, supra), o mediante la expresión de proteínas expresadas específicamente en las células del gusto. Los miembros de la familia T1R pueden tener la capacidad de actuar como receptores para la transducción del sabor dulce o para distinguir entre varias otras modalidades gustativas. Las secuencias de T1R representativas, que incluyen hT1R1, hT1R2 y hT1R3, se identifican más adelante en los ejemplos.Los ácidos nucleicos «T1R» codifican una familia de GPCR con siete regiones transmembrana que tienen «actividad de receptor acoplado a proteína G», por ejemplo, pueden unirse a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promover la producción de segundos mensajeros como IP3, cAMP, cGMP y Ca
2+ a través de la estimulación de enzimas tales como fosfolipasa C y adenilato ciclasa (para una descripción de la estructura y función de los GPCR, véase, por ejemplo, Fong, supra, y Baldwin, supra). Una sola célula gustativa puede contener muchos polipéptidos T1R distintos.Por lo tanto, el término familia «T1R» se refiere a variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos entre especies que: (1) tienen al menos alrededor de 35 a 50% de identidad de secuencia de aminoácidos, opcionalmente alrededor de 60, 75, 80, 85, 90, 95 , 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido T1R, preferiblemente los identificados en el Ejemplo 1, en una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente 50-100 aminoácidos; (2) unirse específicamente a anticuerpos generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en la secuencia polipeptídica T1R descrita en el Ejemplo 1 y variantes de la misma modificadas de forma conservadora; (3) están codificadas por una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente (con un tamaño de al menos alrededor de 100, opcionalmente al menos aproximadamente 500-1000 nucleótidos) en condiciones de hibridación estrictas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de ácido nucleico de T1R contenidas en el Ejemplo 1, y variantes de las mismas modificadas de forma conservadora; o (4) comprenden una secuencia idéntica en al menos aproximadamente un 35 a un 50 % a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de T1R identificada en el Ejemplo 1.Topológicamente, ciertos GPCR quimiosensoriales tienen un «dominio N-terminal»; “dominios extracelulares”; «dominios transmembrana» que comprenden siete regiones transmembrana y bucles citoplásmicos y extracelulares correspondientes; «dominios citoplasmáticos» y un «dominio C-terminal» (véase, por ejemplo, Hoon et al.,
Cell , 96:541-551 (1999); Buck & Axel,
Cell , 65:175-187 (1991)). Estos dominios pueden identificarse estructuralmente utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia, como programas de análisis de secuencias que identifican dominios hidrofóbicos e hidrofílicos (ver, por ejemplo, Stryer,
Biochemistry, (3ª ed. 1988); consulte también cualquiera de una serie de programas de análisis de secuencias basados en Internet, como los que se encuentran en dot.imgen.bcm.tmc.edu). Dichos dominios son útiles para producir proteínas quiméricas y para ensayos in vitro de la invención, por ejemplo, ensayos de unión de ligandos.Por lo tanto, «dominios extracelulares» se refiere a los dominios de los polipéptidos T1R que sobresalen de la membrana celular y están expuestos a la cara extracelular de la célula. Dichos dominios generalmente incluyen el «dominio N terminal» que está expuesto a la cara extracelular de la célula y, opcionalmente, pueden incluir porciones de los bucles extracelulares del dominio transmembrana que están expuestos a la cara extracelular de la célula, es decir, los bucles entre regiones transmembrana 2 y 3, entre las regiones transmembrana 4 y 5, y entre las regiones transmembrana 6 y 7.La región del «dominio N-terminal» comienza en el extremo N-terminal y se extiende hasta una región cercana al inicio del primer dominio transmembrana. Más particularmente, en una realización de la invención, este dominio comienza en el extremo N-terminal y termina aproximadamente en el ácido glutámico conservado en la posición de aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. Estos dominios extracelulares son útiles para ensayos de unión de ligandos in vitro, tanto en fase soluble como sólida. Además, las regiones transmembrana, descritas a continuación, también pueden unirse a ligandos en combinación con el dominio extracelular y, por lo tanto, también son útiles para ensayos de unión de ligandos in vitro.El «dominio transmembrana», que comprende las siete «regiones transmembrana», se refiere al dominio de los polipéptidos T1R que se encuentra dentro de la membrana plasmática y también puede incluir los bucles citoplásmicos (intracelulares) y extracelulares correspondientes. En una realización, esta región corresponde al dominio de los miembros de la familia T1R que comienza aproximadamente en el residuo de ácido glutámico conservado en la posición de aminoácido 563 más o menos 20 aminoácidos y termina aproximadamente en el residuo de aminoácido de tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos. Las siete regiones transmembrana y los bucles extracelulares y citoplásmicos pueden identificarse usando métodos estándar, como se describe en Kyte & Doolittle,
J. Mol. Biol ., 157:105-32 (1982)), o en Stryer, supra.Los «dominios citoplasmáticos» se refieren a los dominios de los polipéptidos T1R que miran hacia el interior de la célula, por ejemplo, el «dominio C-terminal» y los bucles intracelulares del dominio transmembrana, por ejemplo, el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 1 y 2, el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 3 y 4, y el bucle intracelular entre las regiones transmembrana 5 y 6. «Dominio C-terminal» se refiere a la región que se extiende al final del último dominio transmembrana y el extremo C-terminal de la proteína, y que normalmente se encuentra dentro del citoplasma. En una realización, esta región comienza en el residuo de aminoácido de tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos y continúa hasta el extremo C-terminal del polipéptido.El término «región de unión a ligando» o «dominio de unión a ligando» se refiere a secuencias derivadas de un receptor gustativo, particularmente un receptor gustativo que incorpora sustancialmente al menos el dominio extracelular del receptor. En una realización, el dominio extracelular de la región de unión al ligando puede incluir el dominio N-terminal y, opcionalmente, porciones del dominio transmembrana, como los bucles extracelulares del dominio transmembrana. La región de unión al ligando puede ser capaz de unirse a un ligando y, más particularmente, a un compuesto que mejora, imita, bloquea y/o modula el sabor, por ejemplo, el sabor dulce o umami.La frase «heteromultímero» o «complejo heteromultimérico» en el contexto de los receptores T1R o polipéptidos de la invención se refiere a una asociación funcional de al menos un receptor T1R y otro receptor, típicamente otro polipéptido receptor T1R (o, alternativamente, otro receptor no T1R). polipéptido receptor). Para mayor claridad, la codependencia funcional de los T1R se describe en esta solicitud como reflejo de su posible función como complejos heterodiméricos de receptores gustativos. Sin embargo, como se discutió anteriormente, la codependencia funcional puede reflejar alternativamente una interacción indirecta. Por ejemplo, T1R3 puede funcionar únicamente para facilitar la expresión superficial de T1R1 y T1R2, que pueden actuar de forma independiente como receptores del gusto. Alternativamente, un receptor del gusto funcional puede estar compuesto únicamente por T1R3,La frase «efectos funcionales» en el contexto de ensayos para probar compuestos que modulan la transducción gustativa mediada por miembros de la familia T1R incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirecta o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Incluye unión de ligandos, cambios en el flujo de iones, potencial de membrana, flujo de corriente, transcripción, unión a proteínas G, fosforilación o desfosforilación de GPCR, ensayos basados en cambios de conformación, transducción de señales, interacciones receptor-ligando, concentraciones de segundos mensajeros (p. ej., CAMP, cGMP , IP3 o Ca
2+ intracelular ), in vitro, in vivo y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como aumentos o disminuciones de la liberación de neurotransmisores u hormonas.Por «determinar el efecto funcional» en el contexto de los ensayos se entiende ensayos para un compuesto que aumenta o disminuye un parámetro que está directa o indirectamente bajo la influencia de un miembro de la familia T1R, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Dichos efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbencia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o de solubilidad, fijación de parche, colorantes sensibles al voltaje, corrientes de células enteras, salida de radioisótopos, marcadores inducibles, ovocitos. expresión del gen T1R; expresión de T1R en células de cultivo tisular; activación transcripcional de genes T1R; ensayos de unión a ligandos; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; ensayos de flujo de iones; cambios en los segundos mensajeros intracelulares como CAMP, cGMP y trifosfato de inositol (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisores, ensayos conformacionales y similares.Los «inhibidores», «activadores» y «moduladores» de genes o proteínas T1R se utilizan para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas mediante ensayos in vitro e in vivo para la transducción del gusto, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos.Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente la estimulación, disminuyen, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan a la baja la transducción gustativa, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o regulan al alza la transducción gustativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (por ejemplo, ebnerina y otros miembros de la familia de transportadores hidrofóbicos); proteínas G; quinasas (p. ej., homólogos de rodopsina quinasa y quinasas de receptor beta adrenérgico que están involucradas en la desactivación y desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan los receptores. Los moduladores pueden incluir versiones modificadas genéticamente de miembros de la familia T1R, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y similares que se producen de forma natural y sintética. Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la expresión de miembros de la familia T1R en células o membranas celulares, la aplicación de supuestos compuestos moduladores, en presencia o ausencia de saborizantes, por ejemplo, saborizantes dulces, y luego la determinación de los efectos funcionales sobre la transducción del gusto, como se describe arriba. Las muestras o ensayos que comprenden miembros de la familia T1R que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de modulación. Muestras de control positivo (p. ej.A las muestras de control negativo (p. ej., tampón sin un estímulo gustativo añadido) se les asigna un valor de actividad T1R relativo del 0%. La inhibición de un T1R se logra cuando una mezcla de la muestra de control positivo y un modulador da como resultado que el valor de actividad de T1R en relación con el control positivo sea de aproximadamente 80 %, opcionalmente 50 % o 25-0 %. La activación de un T1R por un modulador solo se logra cuando el valor de actividad de T1R relativo a la muestra de control positivo es 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, opcionalmente 100 %, opcionalmente 150 %, opcionalmente 200-500 % o 1000 -3000% superior.Los términos «purificado», «sustancialmente purificado» y «aislado» como se usan en el presente documento se refieren al estado de estar libre de otros compuestos diferentes con los que el compuesto de la invención se asocia normalmente en su estado natural, de modo que el «purificado , «sustancialmente purificado» y sujeto «aislado» comprende al menos 0,5%, 1%, 5%, 10% o 20%, y lo más preferiblemente al menos 50% o 75% de la masa, en peso, de un muestra dada. En una realización preferida, estos términos se refieren al compuesto de la invención que comprende al menos el 95% de la masa, en peso, de una muestra dada. Como se usa aquí, los términos «purificado», «sustancialmente purificado» y «aislado», cuando se refieren a un ácido nucleico o proteína, también se refieren a un estado de purificación o concentración diferente al que ocurre naturalmente en el mamífero, especialmente en el cuerpo humano. Cualquier grado de purificación o concentración superior a la que se produce naturalmente en el cuerpo de los mamíferos, especialmente en los humanos, incluida (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no se asocia en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de «aislados». El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en este documento, pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procesos conocidos por los expertos. en el arte incluyendo (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no se asocia en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de «aislados». El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en este documento, pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procesos conocidos por los expertos. en el arte incluyendo (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no se asocia en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de «aislados». El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en este documento, pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de métodos y procesos conocidos por los expertos. en el arteEl término «ácido nucleico» o «secuencia de ácido nucleico» se refiere a un oligonucleótido desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de cadena simple o doble. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras similares a ácidos nucleicos con esqueletos sintéticos (ver, por ejemplo,
Oligonucleótidos y análogos, un enfoque práctico , ed. F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategies,
Annals of the NY Academy of Sciences , Vol. 600, Eds. Baserga et al. (NYAS 1992), Milligan
J. Med. Chem . 36:1923-1937 (1993),
Investigación y aplicaciones antisentido(1993, CRC Press), WO 97/03211; documento WO 96/39154; Mata,
Toxicol. aplicación Farmacol . 144:189-197 (1997); Strauss-Soukup,
Bioquímica 36:8692-8698 (1997); Samstag,
Antisense Nucleic Acid Drug Dev , 6:153 – 156 (1996)).A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma (p. ej., sustituciones de codones degeneradas) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando, por ejemplo, secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al.,
Nucleic Acid Res ., 19:5081 ). (1991), Ohtsuka y col.,
J. Biol. Chem ., 260:2605-2608 (1985), Rossolini y col.,
Mol. Cell. Probes , 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.Los términos «polipéptido», «péptido» y «proteína» se usan indistintamente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.El término «dominio de translocación de la membrana plasmática» o simplemente «dominio de translocación» se refiere a un dominio polipeptídico que, cuando se incorpora a una secuencia de codificación polipeptídica, puede «acompañar» o «translocar» con mayor eficacia la proteína híbrida («fusión») a la célula. membrana plasmática que sin el dominio. Por ejemplo, un «dominio de translocación» puede derivarse del extremo amino del polipéptido del receptor de rodopsina bovino, un receptor transmembrana 7. Sin embargo, puede usarse rodopsina de cualquier mamífero, al igual que otras secuencias que facilitan la translocación. Por lo tanto, el dominio de translocación es particularmente eficiente en la translocación de proteínas de fusión transmembrana 7 a la membrana plasmática, y una proteína (por ejemplo, un polipéptido del receptor del gusto) que comprende un dominio de translocación amino terminal será transportado a la membrana plasmática más eficientemente que sin el dominio. Sin embargo, si el dominio N-terminal del polipéptido es activo en la unión, como ocurre con los receptores T1R de la presente invención, puede preferirse el uso de otros dominios de translocación. Por ejemplo, puede usarse un péptido que interactúa con el dominio PDZ, como se describe en el presente documento.Las composiciones de «dominio de translocación», «dominio de unión a ligando» y receptores quiméricos descritas en el presente documento también incluyen «análogos» o «variantes conservativas» y «miméticos» («peptidomiméticos») con estructuras y actividad que corresponden sustancialmente a las secuencias ejemplares. . Por lo tanto, los términos «variante conservativa» o «análogo» o «mimético» se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada, de modo que los cambios no alteran sustancialmente la estructura del polipéptido (la variante conservativa) y/o actividad, tal como se define en este documento. Estos incluyen variaciones conservativamente modificadas de una secuencia de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos, adiciones o eliminaciones de aquellos residuos que no son críticos para la actividad de la proteína, o sustitución de aminoácidos con residuos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos,Más particularmente, las «variantes modificadas de forma conservadora» se aplican tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada.Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que un codón especifica una alanina, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado.Tales variaciones de ácido nucleico son «variaciones silenciosas», que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento, que codifica un polipéptido, también describe todas las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido, está implícita en cada secuencia descrita.Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, una directriz ejemplar para seleccionar sustituciones conservativas incluye (residuo original seguido de sustitución ejemplar): ala/gly o ser; arg/lis; asn/gln o suyo; asp/glú; cis/ser; ginebra/asn; gly/áspid; gly/ala o pro; su/asn o ginebra; ile/leu o val; leu/ile o val; lys/arg o gin o glu; metlleu o tyr o ile; phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp o phe; val/ile o leu. Una directriz ejemplar alternativa utiliza los siguientes seis grupos, cada uno de los cuales contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (I); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); (ver también, por ejemplo, Creighton,
Proteínas , WH Freeman and Company (1984); Schultz y Schimer,
Principios de estructura de proteínas , Springer-Vrlag (1979)). Un experto en la técnica apreciará que las sustituciones identificadas anteriormente no son las únicas sustituciones conservadoras posibles. Por ejemplo, para algunos propósitos, uno puede considerar todos los aminoácidos cargados como sustituciones conservativas entre sí, ya sean positivos o negativos. Además, las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada también pueden considerarse «variaciones modificadas de forma conservadora».Los términos «mimético» y «peptidomimético» se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos, por ejemplo, dominios de translocación, dominios de unión a ligandos o receptores quiméricos de la invención. El mimético puede estar completamente compuesto de análogos de aminoácidos sintéticos, no naturales, o puede ser una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales siempre que tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético.Al igual que con los polipéptidos de la invención que son variantes conservativas, la experimentación rutinaria determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, es decir, si su estructura y/o función no se altera sustancialmente. Las composiciones miméticas de polipéptidos pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales, que son típicamente de tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos distintos de los enlaces de enlace amida natural («enlace peptídico»); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos naturales; oc) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, un giro beta, giro gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa, y similares. Un polipéptido se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios químicos distintos de los enlaces peptídicos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales pueden unirse mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). ). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de enlace amida tradicionales («enlace peptídico») incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(═O)-CH N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de enlace amida tradicionales («enlace peptídico») incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(═O)-CH N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de enlace amida tradicionales («enlace peptídico») incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(═O)-CH
2 — para —C(═O)—NH—), aminometileno (CH
2 —NH), etileno, olefina (CH═CH), éter (CH
2 —O), tioéter (CH
2 —S), tetrazol (CN
4 ), tiazol, retroamida, tioamida o éster (ver, por ejemplo, Spatola,
Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins , Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY (1983) )). Un polipéptido también se puede caracterizar como mimético porque contiene todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos naturales; los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patentes.Una «marca» o un «resto detectable» es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen
32 P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (p. ej., como se usan comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en el péptido o se usa para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido.Una «sonda de ácido nucleico u oligonucleótido marcado» es una que está unida, ya sea de forma covalente, a través de un enlazador o un enlace químico, o de forma no covalente, a través de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de tal manera que la presencia del la sonda puede detectarse detectando la presencia del marcador unido a la sonda.
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